α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用制造技术

本发明专利技术提供α

【技术实现步骤摘要】
α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用


[0001]本专利技术涉及α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，涉及分子生物学


技术介绍

[0002]环内过氧化合物是指环内包括过氧桥键的化合物，其具有多种生物活性，随着越来越多环内过氧化合物的应用，使得环内过氧化合物的体外催化合成成为了新的研究方向，其中，环内过氧化合物的合成难点之一就是环和过氧桥键的催化合成。
[0003]例如，青蒿素是一种具有环内过氧桥键的倍半萜的化合物，青蒿素的抗疟疾活性与“过氧桥键”密不可分。青蒿素的主要来源为植物提取，但是野生型青蒿中青蒿素含量仅占干重0.1％
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1％，因此，研发青蒿素的体外合成方法就十分重要，而体外合成青蒿素的难点就在于环内过氧桥键的合成。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用和一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法。
[0005]本专利技术第一方面提供了α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
[0006]本专利技术第二方面提供了与α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶同源性在70％以上的酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
[0007]本专利技术第三方面提供了α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成青蒿素环内过氧桥键中的应用，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
[0008]进一步地，编码所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因具有如SEQIDNO.2所示的序列。
[0009]进一步地，在催化合成过程中，还需加入维生素C、MgCl2、NADPH、DTT和青蒿酸。
[0010]进一步地，所述催化合成过程具体包括如下步骤：
[0011]在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα
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酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mM MgCl2、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。
[0012]本专利技术第四方面提供了一种α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的制备方法，包括如下步骤：
[0013]提取青蒿总RNA，并以所述总RNA为模板合成得到cDNA；
[0014]从所述cDNA中提取得到如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；
[0015]将所述核苷酸序列导入表达载体pET30a中，构建得到重组载体；
[0016]将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，得到所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶。
[0017]进一步地，将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，具体包括：
[0018]将导入重组载体后的大肠杆菌在37℃下培养至OD600为0.6，加入0.5mM IPTG，在16℃下继续培养12h，培养结束后，收集菌体，加入裂解液并纯化得到所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶。
[0019]本专利技术第五方面提供了一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法，通过α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶催化得到，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
[0020]进一步地，所述方法包括如下步骤：
[0021]在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα
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酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mM MgCl2、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。
[0022]本专利技术的实施，至少具有以下优势：
[0023]1、本专利技术提供了一种催化合成环内过氧桥键的方法，并且以青蒿素中环内过氧桥键的合成为例，表明α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶能够催化合成环内过氧桥键，对于含有环内过氧桥键化合物的体外合成具有重要意义。
[0024]2、本专利技术提供的青蒿素的合成方法简单，成本较低，适合青蒿素的规模化生产。
附图说明
[0025]图1为α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的SDS
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PAGE图；
[0026]图2为本实施例中催化产物与青蒿素标准品的UPLC
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QQQ
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MS对比图；
[0027]图3为本实施例中催化产物与青蒿素标准品的UPLC
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QTOF
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MS对比图；
[0028]图4为本实施例中催化产物与青蒿素标准品的一级质谱和二级质谱比较图。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]实施例1α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的制备
[0031]步骤1、青蒿基因组总RNA的提取
[0032]取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，并加入盛有裂解液的1.5mL离心管中，充分振荡后按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提青蒿总RNA。
[0033]步骤2、编码α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因的克隆
[0034]以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据编码α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因设计特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增基因，并测序；
[0035]编码α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因具有如SEQIDNO.2所示的序列。
Buffer，收集流出蛋白液；
[0048]图1为α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的SDS
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PAGE图，如图1所示，该酶的大小为35.4kDa，并根据其核苷酸序列推测得到氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
[0049]实施例2、α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶体外催化实验
[0050]在100mM PBS缓冲液(pH7.0)的反应体系中，加入100μgα
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酮戊二酸依赖型双加氧酶、200μM底物青蒿酸、10mM维生素C、10mM MgCl2、200nM 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.与α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶同源性在70％以上的酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。3.α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成青蒿素环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因具有如SEQ ID NO.2所示的序列。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，在催化合成过程中，还需加入维生素C、MgCl2、NADPH、DTT和青蒿酸。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化合成过程具体包括如下步骤：在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα
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酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mM MgCl2、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，付雪晴，王玉亮，刘航，刘品，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：