一种环己酮单加氧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环己酮单加氧酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明专利技术的环己酮单加氧酶突变体对多种潜手性硫醚具有较高的活力，尤其是对于奥美拉唑硫醚，在野生型环己酮单加氧酶不能转化该底物生产手性奥美拉唑的情况下，本发明专利技术的突变体能够不对称氧化潜手性奥美拉唑硫醚生产手性奥美拉唑，且催化效率较高，ee值可达99％，同时对于其他潜手性硫醚也有较高的转化效率，具有良好的工业应用前景。的工业应用前景。的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种环己酮单加氧酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种环己酮单加氧酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程


技术介绍

[0002]手性亚砜是一类重要的手性化合物，可用于合成手性辅助试剂和手性配体，同时，手性亚砜在医药领域均具有广泛的应用。
[0003]埃索美拉唑(S
‑
奥美拉唑，esomeprazole)，化学名为(S)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
[[(4
‑
甲氧基
‑
3,5
‑
二甲基
‑2‑
吡啶基)甲基]亚硫酰基]‑
1H
‑
苯并咪唑，是一种指定用于治疗消化不良、消化性溃疡(PUD)，胃食管反流病(GORD/GERD)和Zollinger
‑
Ellison综合征的质子泵抑制剂(PPI)，同时也是第一个上市的光学纯质子泵抑制剂。埃索美拉唑较消旋体奥美拉唑具有更好的抑酸效果。埃索美拉唑的生产方法主要有化学合成法及生物酶法，目前较成熟的化学合成法反应复杂、副产物多，而生物法因绿色环保、步骤简单、立体选择性高而具有重要的研究价值。生物催化法生产手性药物埃索美拉唑在医药行业拥有巨大的市场空间。目前，国内外主要采用化学法生产手性药物埃索美拉唑，生物法生产埃索美拉唑尚处在实验室研究阶段。国外对生物酶催化法生产埃索美拉唑研究较多并取得了一定的研究成果，而国内在这方面的研究仍存在一大缺口。
[0004]2013年，美国Codexis公司用具有30个以上突变位点的工程化环己酮单加氧酶突变体，在75mL反应体系中，加入100g/L的奥美拉唑硫醚底物，并使混合物脱气、充气4次，通过分批补料酶与辅酶，并在氧气氛中搅拌反应，转速为200rpm下共转化69h，最终使得转化率达99.6％，e.e.值为99.9％。2011年，Peter,Eva等分离到一株氧化奥美拉唑硫醚的赖氨酸芽孢杆菌。采用分批补料酶与底物的方式，每5mL的LB培养基中，添加菌体量为25mg CDW，底物总添加量为0.1g/L，在200rpm下摇瓶转化24h，最终得到了77％的转化率，e.e.值为100％。2019年，许建和团队构建了一个工程化的环己酮单加氧酶突变体，具有15个以上突变位点，选择性氧化奥美拉唑硫醚生成所需的(S)
‑
奥美拉唑。奥美拉唑硫醚加载为15mM底物时，在6h内完全转化。CHMO在手性药物的合成领域存在巨大的应用潜力，其中包括本研究中的埃索美拉唑，2014年5月关键性的旋光纯的埃索美拉唑的盐(包括钠盐、镁盐、锂盐、钾盐、钙盐等)专利到期，面临具有丰富利润的市场，但化学有其工艺复杂、环境污染、副产物多、光学选择性不高等缺点，生物法生产埃索美拉唑因其具有环境友好、条件温和、特性强等优点，受到越来越多的关注。环己酮单加氧酶因其对奥美拉唑硫醚高度的立体选择性而具有工业化生产的可能性。
[0005]因此，急需得到更多不对称氧化潜手性奥美拉唑硫醚生产手性埃索美拉唑的环己酮单加氧酶以早日实现手性埃索美拉唑的大规模工业化生产以及手性埃索美拉唑在医药领域的大规模应用。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种不对称氧化潜手性硫醚生产手性亚砜的转化效率高的环己酮单加氧酶(Cyclohexanone monooxygenase，简称CHMO，EC 1.1.1.1)。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种环己酮单加氧酶突变体，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，同时将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，得到突变体F434I/T435A。
[0008]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，同时将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，得到突变体F434I/T435A/L437C。
[0009]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，同时将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F507V)，得到突变体F434I/T435A/L437C/F507V。
[0010]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F507V)，同时将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺(L428Q)，得到突变体F434I/T435A/L437C/F507V/L428Q。
[0011]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F507V)，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺(L428Q)，同时将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸(S440I)，得到突变体F434I/T435A/L437C/F507V/L428Q/S440I。
[0012]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F507V)，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺(L428Q)，将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸(S440I)，同时将第328位赖氨酸突变为半胱氨酸(K328C)，得到突变体F434I/T435A/L437C/F507V/L428Q/S440I/K328C。
[0013]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸(F434I)，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸(T435A)，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸(L437C)，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F507V)，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺(L428Q)，将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸(S440I)，将第328位赖氨酸突变为半胱氨酸(K328C)，同时将第279位苯丙氨酸突变为缬氨酸(F279V)，得到突变体F434I/T435A/L437C/F507V/L428Q/S440I/K328C/F279V。
[0014]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环己酮单加氧酶突变体，其特征在于：所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时将第435位苏氨酸突变为丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，同时将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸，同时将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸，同时将第328位赖氨酸突变为半胱氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸，将第328位赖氨酸突变为半胱氨酸，同时将第279位苯丙氨酸突变为缬氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环己酮单加氧酶的第434位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，将第435位苏氨酸突变为丙氨酸，将第437位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第507位苯丙氨酸突变为缬氨酸，将第428位亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第440位丝氨酸突变为异亮氨酸，将第32...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国超，魏世誉，倪晔，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：