用于类固醇C19-羟基化的P450BM3单加氧酶变体制造技术

本发明专利技术涉及用于类固醇及其衍生物的C19羟基化或用于改善BM3蛋白表达的新型重组巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞色素P450

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于类固醇C19
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羟基化的P450 BM3单加氧酶变体


[0001]本专利技术涉及用于类固醇及其衍生物的C19羟基化或用于改善BM3蛋白表达的新型重组巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞色素P450
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单加氧酶(P450
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BM3)变体。特别地，本专利技术还涉及使用P450
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BM3变体生产雌酮和雌二醇的方法和工艺。本专利技术还涉及用于表达这些P450
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BM3变体的核苷酸序列、构建体和载体。

技术介绍

[0002]类固醇激素雌酮和雌二醇及其衍生物用作药物，例如用于更年期激素治疗、避孕和肿瘤学，或是合成其他类固醇产物的重要中间体。雌酮和雌二醇可以从植物甾醇开始分几个步骤生成。植物甾醇的不同降解产物在甾环系统的C19位含有一个甲基，需要将其去除以便在甾环系统的A环芳构化下合成雌酮和雌二醇及其衍生物。Inhoffen描述了这种通过热分解来合成雌二醇的芳构化(Inhoffen 1947)，Hershberg等人描述了这种通过热分解来合成雌酮的芳构化(Hershberg 1950)。然而，产率并非最佳且形成了各种副产物。Templeton等人和Numazawa等人通过C19位被氧化的类固醇产物描述了这种芳构化(F.Templeton 1997)，(Mitsuteru Numazawa 2009)。因此，将C19位的甲基羟基化并因此支持进一步衍生化并最终去除19位的取代基的方法可以为雌酮和雌二醇及其衍生物的新型和改进合成铺平道路。
[0003]作为催化剂的酶的典型特征是对天然底物具有优异的区域和/或立体选择性，但可能表现出低的热稳定性和溶剂稳定性。由于底物谱窄，相较于化学催化剂，酶通常非常专一，这限制了它们的广泛适用性。因此，寻找或构建一种催化特定反应并具有商业可利用的产率和足够的纯度的酶是一项具有挑战性的工作。
[0004]细胞色素P450单加氧酶(P450s)包含一大群在自然界中普遍存在的血红素酶。从巨大芽孢杆菌中获得的细胞色素P450 BM3(P450
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BM3，BM3)先前已被描述为催化长链脂肪酸、醇和酰胺的NADPH依赖性羟基化，以及不饱和脂肪酸的环氧化(参见例如(Narhi 1986)和(Capdevila 1996))。对于P450
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BM3，酶的还原酶(65kDa)和单加氧酶(55kDa)结构域融合并产生为催化上自给自足的120kDa酶。因此，由于融合还原酶和血红素结构域之间的有效电子转移，P450
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BM3酶在P450单加氧酶中表现出最高的催化速率，参见例如，(Noble MA 1999)和(Munro 1996)。
[0005]BM3变体已被描述用于各种生物转化过程。野生型和突变型P450BM3作为生物催化剂用于生产化学品(包括药品)(Hazel M Girvan2016)。例如，(WO200107630A1)公开了不同有机底物例如N
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杂环芳族化合物的微生物氧化方法，特别是使用具有改变底物特异性的特殊细胞色素P450
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单加氧酶制备靛蓝和印度红的方法。(EP1196603A1)要求保护P450BM3变体，由于其底物结合区域的位点特异性诱变，其在脂肪族羧酸的酶促羟基化中的特征改变，其中F87被Val、Ala或Leu取代，L188被Asn、Gln、Arg、Lys、Ala、Gly、Ser或Trp取代，以及任选的氨基酸26、47、72、74和354位中的至少一个被改变。(WO2016007623A1)公开了细胞色素P450BM3变体以获得关于选自硝苯地平(nifedipine)、普萘洛尔(propranolol)、维拉帕米
(verapamil)和双氯芬酸(diclofenac)的底物的改善活性。(EP1131440A2)公开了一种氧化底物的方法，该底物是选自单萜、倍半萜和二萜或环烯烃的无环或环状萜；或其取代的衍生物，该方法包含用突变体P450 BM3酶氧化所述化合物，所述突变体包含在活性位点被具有较低极性侧链的氨基酸置换的氨基酸。
[0006]上述文件均未公开根据本专利技术的BM3变体的具体结构。此外，上述文件均未涉及类固醇衍生物的C19羟基化，例如用于生产雌二醇或雌酮。相反，其描述了BM3野生型(WT)通常不接受睾酮或类固醇作为底物。
[0007](Kille Sabrina 2011)、(Kille 2010)和(Acevedo
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Rocha 2018)描述了P450BM3变体库和P450 BM3定向进化的使用。Acevedo
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Rocha等人公布了P450 BM3用于睾酮选择性羟基化的定向进化。然而，对于所得突变体，仅在16α/β位获得了相关量的睾酮羟基化。这些发现阻碍了C19羟基化的BM3变体的进一步开发，因为由于其他位置的优先羟基化，在C19位仅获得微量羟基化是不利的(Acevedo
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Rocha 2018)。
[0008]然而，根据本专利技术，出人意料地发现细菌细胞色素P450 BM3单加氧酶(CYPs)的特定新变体可用于催化通过C19
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羟基化、以及以一种有效且可商业利用的方式有效合成雌酮和雌二醇及其衍生物。特别地，出人意料地发现，使用细菌细胞色素P450 BM3单加氧酶的突变体作为生物催化剂，可以实现底物睾酮——δ
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睾酮和雄甾
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1，4
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二烯
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3，17
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二酮的C19
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羟基化。
[0009][0010]这些用途可以通过将突变加入BM3变体中以改善BM3的蛋白质表达而得到进一步支持。

技术实现思路

[0011]根据本专利技术的第一方面，提供了用于催化类固醇或类固醇衍生物的C19羟基化的细胞色素P450 BM3单加氧酶(BM3)变体。根据第一方面的第一个实施方案，BM3变体包含突变F87A和至少一个、优选两个选自以下的其他突变：(i)V78位的突变，优选V78F、V78Y、V78M、V78I或V78L，(ii)A82位的突变，优选A82E、A82Q或A82P。根据本专利技术的第二方面，提供了编码如本文所述的细胞色素P450 BM3单加氧酶变体的核酸。根据本专利技术的第三方面，提供了用于产生细胞色素P450 BM3单加氧酶变体的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞包含编码根据本文所述任何方面的BM3变体的核酸。根据本专利技术的第四方面，提供了
细胞色素P450 BM3单加氧酶(BM3)变体用于产生式I化合物的用途，其中RI和R2形成六元环作为类固醇的一部分。
[0012][0013]根据本专利技术的第五方面，提供了BM3变体用于类固醇或类固醇衍生物的C19
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羟基化的用途。根据本专利技术的第六方面，提供类固醇或其衍生物的C19
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羟基化方法，包括(i)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于催化类固醇或类固醇衍生物C19羟基化的细胞色素P450 BM3单加氧酶(BM3)变体，其中所述BM3变体包含突变F87A和至少一个且优选两个选自以下的其他突变：(i)V78位的突变，优选V78F、V78Y、V78M、V78I或V78L，和(ii)A82位的突变，优选A82E、A82Q或A82P。2.根据权利要求1所述的BM3变体，其特征在于包含(i)至少以下突变：a)V78Y、A82E和F87A(BM3
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254、SEQ ID No.2)、b)V78M、A82E和F87A(BM3
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261、SEQ ID No.3)、c)V78I、A82E和F87A(BM3
‑
263、SEQ ID No.4)、d)V78L、A82E和F87A(BM3
‑
268、SEQ ID No.5).e)V78Y、A82P和F87A(SEQ ID No.6)、f)V78M、A82P和F87A(SEQ ID No.7)、g)V78I、A82P和F87A(SEQ ID No.8)、h)V78L、A82P和F87A(SEQ ID No.9)、i)V78Y、A82Q和F87A(SEQ ID No.10)、j)V78M、A82Q和F87A(SEQ ID No.11)、k)V78I、A82Q和F87A(SEQ ID No.12)、或l)V78L、A82Q和F87A(SEQ ID No.13)、以及至少一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个其他突变，如/或(ii)至少以下突变：a)V78F、A82E、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.14)、b)V78L、A82E、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.15)、c)V78I、A82E、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.16)、d)V78M、A82E、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.17)、e)V78Y、A82E、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.18)、f)V78F、A82P、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.19)、g)V78L、A82P、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.20)、h)V78I、A82P、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.21)、i)V78M、A82P、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.22)、j)V78Y、A82P、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.23)、k)V78F、A82Q、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.24)、l)V78L、A82Q、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.25)、m)V78I、A82Q、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.26)、n)V78M、A82Q、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.27)、o)V78Y、A82Q、F87A、M177Y和A184Y(SEQ ID No.28)、p)V78L、A82E、F87A、S72G、M177Y、V178P、L181Y、A184Y和L188F(SEQ ID N0.117)、q)V78L、A82E、F87A、S72G、T146F、M177Y、V178W、L181Y和A184Y(SEQ ID No.118)、或r)V78L、A82E、F87A、S72G、T146F、M177Y、V178W、L181Y、A184Y、G457S、I458G和A477N
(SEQ ID No.119)。3.根据前述权利要求所述的BM3变体，其特征在于至少一种C19羟基化类固醇或其衍生物或其次级产物的产物产率为＞5％，优选＞8％、＞10％、或＞12％，甚至更优选＞15％、＞20％、＞25％、＞30％、＞35％、＞40％、＞45％或＞50％，最优选＞55％、＞60％、＞65％、＞70％或＞75％。4.根据前述权利要求所述的BM3变体，其特征在于至少一种类固醇或类固醇衍生物的C19羟基化的选择性因子为＞0.1，优选＞0.2或＞0.3，甚至更优选＞0.4或＞0.5，最优选＞0.5、＞0.6、＞0.7、＞0.8或＞0.9。5.根据权利要求1至4中任一项所述的BM3变体，包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置的突变：(A184)、(A191)、(A221)、(A264)、(A321)、(A328)、(A33)、(A330)、(A399)、(A74)、(D168)、(D208)、(D222)、(D363)、(E13)、(E143)、(E267)、(E352)、(E64)、(E82)、(E93)、(F173)、(F205)、(F261)、(F331)、(F393)、(F77)、(F81)、(G240)、(G271)、(G402)、(G415)、(G570)、(G677)、(G85)、(H266)、(H659)、(1153)、(1174)、(I258)、(I259)、(I263)、(I401)、(K210)、(K224)、(L150)、(L181)、(L188)、(L20)、(L262)、(L272)、(L29)、(L324)、(L333)、(L356)、(L437)、(L75)、(L78)、(L86)、(M118)、(M177)、(M185)、(M212)、(M354)、(N70)、(P243)、(P326)、(P329)、(P392)、(P9)、(R147)、(R161)、(R190)、(R203)、(R255)、(R323)、(R47)、(R50)、(S164)、(S176)、(S54)、(S72)、(S89)、(T146)、(T149)、(T260)、(T268)、(T269)、(T327)、(T365)、(T436)、(T438)、(T49)、(T88)、(V178)、(V26)、(V299)、(V314)、(V371)、(V48)、(W325)、(W367)、(W90)、(Y51)、(A225)、(A44)、(D182)、(D80)、(E140)、(E183)、(E337)、(E409)、(G114)、(G227)、(G46)、(H236)、(H92)、(K187)、(K440)、(K76)、(M5)、(N186)、(P172)、(Q189)、(Q397)、(Q403)、(Q404)、(Q73)、(R179)、(R79)、(S270)、(S53)和(T175)。6.根据前述权利要求所述的BM3变体，其中所述BM3变体相较于选自根据SEQ ID No.2至5的变体的至少一种BM3变体具有提高的C19羟基化选择性或产物产率。7.根据前述权利要求所述的BM3变体，其中所述单加氧酶包含突变M177Y和/或A184Y。8.根据前述权利要求所述的BM3变体，其中所述变体至少包含突变(A184D)或(A184D、L188K)或(A184E)或(A184F)或(A184G)或(A184H)或(A184I)或(A184K)或(A184L)或(A184N)或(A184Q)或(A184R)或(A184W)或(A184W、L188F)或(A184Y)或(A184Y、L188K)或(A184Y、R50S)或(A221S)或(A264V)或(A321C)或(A321D)或(A321E)或(A321G)或(A321I)或(A321N)或(A321T)或(A321V)或(A328P)或(A330C)或(A330D)或(A330E)或(A330F)或(A330G)或(A330H)或(A330I)或(A330K)或(A330L)或(A330M)或(A330N)或(A330Q)或(A330R)或(A330S)或(A330T)或(A330T、E352A)或(A330T、F331V)或(A330V)或(A330W)或(A330Y)或(A330Y、W367C)或(A33V)或(A399C)或(A399E)或(A399G)或(A399I)或(A399L)或(A399M)或(A399N)或(A399Q)或(A399R)或(A399S)或(A399T)或(A399V)或(A74C)或(A74C、L75V)或(A74D)或(A74D、F81V)或(A74E)或(A74F)或(A74G)或(A74G、L75C)或(A74H)或(A74I)或(A74I、A184W、L188F)或(A74I、F77A、L181Y、A184W)或(A74I、L181Y、L188K)或(A74I、L181Y、L188R)或(A74I、L188F)或(A74I、L188K)或(A74I、L188R)或(A74I、M177Y、A184R、L188F)或(A74I、M177Y、V178P、A184G)或(A74I、T146F)或(A74I、T146F、L181Y)或(A74I、T146F、L181Y、L188K)或(A74I、T146F、L181Y、L188R)或(A74I、T146F、L188F)或
(A74I、T146F、L188K)或(A74I、T146F、V178P)或(A74I、T146F、V178P、L181Y、L188F)或(A74I、T146F、V178P、L181Y、L188K)或(A74I、T146F、V178P、L188K)或(A74I、T146F、V178P、L188R)或(A74I、T146F、V178W)或(A74I、T146F、V178W、L181Y、L188F)或(A74I、T146F、V178W、L181Y、L188R)或(A74I、T146F、V178W、L188F)或(A74I、T146F、V178W、L188K)或(A74I、T146F、V178W、L188R)或(A74I、V178P)或(A74I、V178P、L181Y)或(A74I、V178P、L181Y、L188R)或(A74I、V178P、L188F)或(A74I、V178P、L188K)或(A74I、V178P、L188R)或(A74I、V178W、L188F)或(A74I、V178W、L188K)或(A74I、V178W、L188R)或(A74K)或(A74L)或(A74M)或(A74N)或(A74P)或(A74Q)或(A74R)或(A74R、L75V)或(A74S)或(A74T)或(A74T、A184D)或(A74T、F77A、L181Y、A184D、L188K)或(A74T、F77A、V178W、A184Y)或(A74T、F77L、L181Y、A184D、L188K)或(A74T、L181Y)或(A74T、L181Y、A184D、L188K)或(A74T、L181Y、A184Y、L188K)或(A74T、L181Y、L188K)或(A74T、L181Y、L188R)或(A74T、L188K)或(A74T、M177Y、L181Y、A184D、L188K)或(A74T、T146F、L181Y、A184D、L188K)或(A74T、T146F、L181Y、L188K)或(A74T、T146F、L181Y、L188R)或(A74T、T146F、L188F)或(A74T、T146F、L188K)或(A74T、T146F、L188R)或(A74T、T146F、V178P)或(A74T、T146F、V178P、L181Y)或(A74T、T146F、V178P、L188K)或(A74T、T146F、V178P、L188R)或(A74T、T146F、V178W)或(A74T、T146F、V178W、L181Y)或(A74T、T146F、V178W、L181Y、L188K)或(A74T、T146F、V178W、L188R)或(A74T、V178P)或(A74T、V178P、L188F)或(A74T、V178P、L188K)或(A74T、V178P、L188R)或(A74T、V178W、L181Y、L188K)或(A74T、V178W、L188K)或(A74T、V178W、L188R)或(A74V)或(A74V、F77A、A184N、L188F)或(A74V、L181Y)或(A74V、L181Y、A184D、L188K)或(A74V、L181Y、A184W、L188F)或(A74V、L181Y、L188F)或(A74V、L188F)或(A74V、L188K)或(A74V、L75V)或(A74V、T146F、L181Y、L188K)或(A74V、T146F、L181Y、L188R)或(A74V、T146F、L188K)或(A74V、T146F、L188R)或(A74V、T146F、V178W)或(A74V、T146F、V178W、L181Y、L188F)或(A74V、V178P、A184W、L188K)或(A74V、V178P、L181Y、L188F)或(A74V、V178P、L181Y、L188K)或(A74V、V178P、L181Y、L188R)或(A74V、V178P、L188F)或(A74V、V178W、L188K)或(A74W)或(A74Y)或(D168Y、F173D)或(D363G、T438C)或(E13D、R47L)或(E143A)或(E143C)或(E143D)或(E143F)或(E143G)或(E143I)或(E143K)或(E143L)或(E143M)或(E143N)或(E143P)或(E143Q)或(E143R)或(E143S)或(E143V)或(E143W)或(E143Y)或(E267A)或(E267C)或(E267D)或(E267G)或(E267K)或(E267P)或(E267R)或(E267S)或(E267T)或(E267Y)或(E352A)或(E352D)或(E352F)或(E352G)或(E352I)或(E352L)或(E352M)或(E352N)或(E352P)或(E352R)或(E352S)或(E352T)或(E352V)或(E352W)或(E352Y)或(E64A)或(E64G)或(E64H)或(E64I)或(E64K)或(E64L)或(E64M)或(E64N)或(E64Q)或(E64V)或(E64W)或(E64Y)或(E82P)或(E93G)或(F173C)或(F173C、F205G)或(F173D)或(F173I)或(F173K)或(F173L)或(F173M)或(F173N)或(F173P)或(F173Q)或(F173R)或(F173S)或(F173S、F205P)或(F173V)或(F173W)或(F173Y)或(F173Y、I174F)或(F205A)或(F205C)或(F205D)或(F205D、D208N)或(F205E)或(F205G)或(F205H)或(F205I)或(F205K)或(F205L)或(F205M)或(F205N)或(F205P)或(F205R)或(F205S)或(F205T)或(F205V)或(F205W)或(F205Y)或(F261A)或(F261C)或(F261D)或(F261G)或(F261I)或(F261L)或(F261M)或(F261N)或(F261Q)或(F261S)或(F261T)或(F261V)或(F261W)或(F261Y)或(F331C)或(F331H)或(F331I)或(F331L)或(F331M)或(F331N)或(F331P)或(F331T)或(F331V)或(F331W)或
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【专利技术属性】
技术研发人员：O，
申请(专利权)人：拜耳医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：