一种耐高温漆酶及基因与菌株和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种耐高温漆酶及基因与菌株和应用。所述耐高温漆酶CotAGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，经重新设计与改造而来，具有显著提高的耐高温特性和活性。本发明专利技术通过对漆酶野生型漆酶CotA的改造，得到了具有耐高温、高酶活力的漆酶CotAGold。本发明专利技术得到的漆酶CotAGold为漆酶在纸浆脱色、牛仔裤漂洗等工业领域的应用奠定了基础。基础。基础。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温漆酶及基因与菌株和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种耐高温漆酶及编码基因、重组表达载体、重组表达菌株，以及它们的制备方法和应用。该酶可用于黄曲霉毒素B1的降解、靛蓝等染料脱色等多个工业领域。

技术介绍

[0002]漆酶是一种多酚氧化酶，具有较强的氧化能力和广泛的底物。因此，漆酶有着非常广泛的应用。例如，在食品中，漆酶可以用来降解食品或饲料中的黄曲霉毒素，从而使食品脱毒并延长其储存时间。还可用于水解啤酒中的不良酚类，改善口感，延长储存时间；在纺织领域，它可以用来降解有机染料，其产品是清洁的水；在造纸领域，可用于木质素脱色和废水处理；在生物传感器领域，作为一种生物传感器，它可以检测吗啡、可待因和儿茶酚胺，判断果汁中的苯酚或其他酶，以及植物中的黄酮类化合物。
[0003]黄曲霉毒素B1是玉米、花生和其他谷物中常见的真菌毒素，是由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒次级代谢产物。它具有很强的毒性、致癌性和致畸性，污染多种经济作物，造成食品、饲料等安全问题，会导致肝癌、生长迟缓、生殖系统损害等疾病，对人畜健康构成极大威胁。由于粮食和饲料中真菌毒素的污染，迫切需要开发一种多功能酶来降解包括黄曲霉毒素B1在内的多种真菌毒素。
[0004]目前的脱毒方法主要包括物理、化学和生物方法。物理方法包括辐射法、热处理法和吸附法。辐射法本身就存在放射性污染的问题，被辐射的粮食产品也存在一些安全问题。热处理过程中的高温会破坏谷物的品质和风味，脱毒效果不完全。吸附法存在吸附剂用量大、吸附毒素种类有限等问题。化学方法采用碱处理和氧化处理来破坏分子结构以达到脱毒的目的，但这种方法也会破坏谷物的营养成分，并引入新的化学试剂。降解产物的安全性尚不清楚。生物降解是指利用微生物或其酶和制剂通过生物催化进行脱毒。脱毒条件温和有效。目前，大量的研究主要集中在微生物及其代谢产物降解的毒素的单一脱毒上。脱毒方法普遍性差，针对性强，整体性差。也有多种益生菌同时降解两种毒素的方法，但这种方法效率低，实验复杂，适用范围窄，不适用于天然有毒食品和谷物。
[0005]漆酶的工业应用不仅要求漆酶具有高活性，而且要求漆酶具有良好的热稳定性。例如，在纸浆漂洗中，纸浆漂洗和干燥需要高温。普通的不耐热漆酶在高温下容易失去活性。在服装制造领域，漆酶用于牛仔裤脱色过程需要高温环境。纸浆在高温环境下的脱色效率也有待提高。因此，耐高温漆酶具有广阔的工业应用前景。但现阶段漆酶的工业化应用亟待解决，包括但不限于以下几点：1)缺乏耐高温漆酶品种；2)活性和酶产量有限；3)经济成本高。
[0006]对于以上的问题，采用基因工程的方法改造漆酶是一个非常有效的方法，这种方法不仅能改良酶的特性，获得耐高温的漆酶，而且可以提高酶的产量，同时经济成本大大降低，满足工业化应用的要求。

技术实现思路

[0007]针对目前如上所述漆酶的缺陷或不足进行改进，本专利技术的目的在于提供一种耐高温漆酶CotAGold及其编码基因cotAgold与应用，其中通过对关键的来自芽孢杆菌的原始漆酶CotA其氨基酸序列、用于编码该漆酶基因cotA的序列等进行改进，克服其耐热性不佳、产量偏低等问题。本专利技术可以实现该漆酶CotAGold在工业中的应用，能够得到具有很好应用前景的漆酶的生产菌种，非常利于漆酶CotAGold的推广应用。本专利技术得到的漆酶CotAGold可应用于各个领域，是一种新的能够广泛应用于染料脱色、造纸、食品、饲料、纺织等工业领域的耐高温漆酶，尤其可以应用于黄曲霉毒素的降解和靛蓝、木质素等染料的脱色，大大降低了生产所需成本，提高了效率。
[0008]本专利技术的第一方面提供一种耐高温漆酶CotAGold，所述漆酶CotAGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本专利技术的第二方面提供获取所述的漆酶CotAGold的方法，包括对野生型漆酶CotA进行改造：将113位的天冬氨酸D突变为脯氨酸P，将187位天冬氨酸D突变为甘氨酸G，将255位的异亮氨酸I突变为亮氨酸L。
[0010]本专利技术的第三方面提供一种耐高温漆酶基因cotAgold，用于编码所述的漆酶，所述漆酶基因cotAgold的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]通过本专利技术所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对原始漆酶CotA其氨基酸序列、用于编码该漆酶基因cotA的序列等进行改进，可有效解决现有漆酶耐热性不强、催化效率不高等问题。
[0012]本专利技术的第四方面提供一种重组表达载体，包括所述的漆酶基因cotAgold。
[0013]本专利技术的第五方面提供所述的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：在所述的漆酶基因cotAgold的两端分别引入限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切位点；将经NdeⅠ和HindⅢ双酶切的cotAgold基因插入同样经NdeⅠ和HindⅢ双酶切的大肠杆菌表达载体pET21a，获得漆酶重组表达载体pET21a
‑
cotAgold。
[0014]本专利技术的第六方面提供一种重组表达菌株，包括所述的重组表达载体，所述重组表达菌株的宿主细胞为大肠杆菌。
[0015]根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：用限制性内切酶BamHⅠ将重组表达载体pET21a
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cotAgold线性化；通过电转化的方式将线性化的重组表达载体pET21a
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cotAgold导入大肠杆菌中，并在含有氨苄霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆即获得重组表达菌株。
[0016]本专利技术的第七方面提供所述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：将漆酶重组表达载体导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
[0017]本专利技术的第八方面提供所述的耐高温漆酶的生产方法，培养所述的重组表达菌株，从培养物中获得漆酶。
[0018]具体包括以下步骤：
[0019](1)以上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
[0020](2)发酵该重组菌株，获得表达的漆酶CotAGold；
[0021](3)收集并纯化所表达的漆酶CotAGold。
[0022]根据本专利技术一种具体的实施方式，通过上述重组表达菌株制备漆酶的方法包括如
下步骤：挑取重组表达菌株单菌落接种至5mL LB液体培养基中，37℃，170rpm过夜培养作为种子液，再将2mL的种子液接到含0.1mg/mL的摇瓶中。培养条件为37℃，170rpm，培养2
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3h，然后再加0.1mM IPTG、1mM的铜离子，培养3h，进行离心收菌，置于
‑
10℃冰箱保存。取发酵上清液测定漆酶的活性，利用BCA法测定蛋白含量。
[0023]本专利技术的第九方面提供所述的漆酶的应用，将所述的漆酶与黄曲霉毒素B1接触，用于对其的降解。
[0024]本专利技术的第十方面提供所述的漆酶的另一种应用，将所述的漆酶与染料接触，优选的是应用于靛蓝降解。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐高温漆酶CotAGold，其特征在于，所述漆酶CotAGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.获取权利要求1所述的漆酶CotAGold的方法，包括对野生型漆酶CotA进行改造：将113位的天冬氨酸D突变为脯氨酸P，将187位天冬氨酸D突变为甘氨酸G，将255位的异亮氨酸I突变为亮氨酸L。3.一种耐高温漆酶基因cotAgold，用于编码权利要求1所述的漆酶，其特征在于，所述漆酶基因cotAgold的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的漆酶基因cotAgold。5.权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：在权利要求3所述的漆酶基因cotAgold的两端分别引入限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切位点；将经NdeⅠ和HindⅢ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，乐琛，张俊雄，雷磊，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：