新月弯孢霉甾体C14α-羟化酶CYP5103B5突变体构建及其应用制造技术

本发明专利技术专利提供了新月弯孢霉甾体C14α

【技术实现步骤摘要】
新月弯孢霉甾体C14
α
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羟化酶CYP5103B5突变体构建及其应用

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[0001]本专利技术应用基因工程和酶工程技术，具体涉及C14α
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羟化酶突变体及其应用。

技术介绍
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[0002]甾体激素类药物被广泛应用于临床治疗。该类药物主要用于抗病毒、消炎、抗肿瘤、抗癌细胞活性、免疫调节、抗过敏、避孕、治疗心脑血管疾病以及促进骨骼发育等方面。甾体化合物的结构复杂，其生理及药理活性取决于甾体母核特定位点的取代基。
[0003]14α
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羟基化反应是一个非常重要的过程，14α
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羟基甾体化合物具有抗癌生物活性和特殊的促性腺激素作用。例如孕酮的14α
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羟基衍生物14α
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羟基
‑
孕甾
‑4‑
烯
‑
3，20
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二酮可以作为替代化学合成途径的药物前体，生成一种广泛应用于兽用避孕及治疗的高活性抗促性腺激素药物普罗孕酮的前体；雄烯二酮(AD)的14α
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羟基衍生物14α
‑
羟基
‑4‑
烯
‑
3，17
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二酮，可以作为合成14α
‑
羟基
‑4‑
烯
‑
3，6，17
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三酮的前体，且14α
‑
羟基
‑4‑
烯
‑
3，6，17
‑
三酮被证明能够抑制人体胎盘和子宫肿瘤的芳香酶活性和雌激素的合成，并可用于乳腺癌或雌激素依赖性子宫肿瘤的化疗。除了用于抗炎及避孕外，其中几种14α
‑
羟基甾体化合物还表现出抗肿瘤活性。除此之外，14α
‑
羟基构型可以转化为有心脏活性类固醇结构特征的14β
‑
构型，14β
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羟基甾体化合物的衍生物是重要的心肌收缩增强剂。据报道，14
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OH
‑
5β，14β
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孕甾烷的C
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3糖苷衍生物已被证明与心肌的糖苷受体会产生强烈的相互作用。
[0004]尽管14α
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羟基甾体化合物有许多生物活性，但合成14α
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羟基甾体衍生物的方式有限。由于甾体母核C14三级结构位置的特殊性，使得利用化学合成的方法很难在该位置引入羟基，但甾体微生物转化能够通过一步将氧原子插入甾体分子的远程非活化的C
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H键，且具有极好的区域和立体选择性，为工业生产有价值的中间体提供了有效的解决方案。丝状真菌是甾体选择性羟基化商业菌株的主要来源。利用新月弯孢霉虽然可以在孕酮的C14α位引入羟基，但它无法进一步积累14α
‑
羟基孕酮，并且使用新月弯孢霉存在一些潜在的应用缺陷。一方面，新月弯孢霉生长缓慢，产孢量较弱，液体培养时很难控制其形态同质性。另一方面，新月弯曲霉构成了潜在的安全风险，因为据报道，这种真菌可能会在人类中引起几种类型的感染，如角膜炎和皮肤病。相比之下，酿酒酵母以其自然优势而闻名，如快速生长、成熟的基因操作和使用安全。因此，我们克隆鉴定了新月弯孢霉CICC40301中的C14α
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羟化酶基因CYP5103B5。C14α
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羟化酶CYP5103B5虽然可以转化孕酮但它无法进一步积累14α
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羟基孕酮。
[0005]为了改善新月弯孢霉C14α
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羟化酶CYP5103B5基因对底物孕酮的羟化特异性，利用定点突变技术对其进行分子水平上的改造，筛选获得了两个对孕酮具有高羟化特异性C14α
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羟化酶突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V1331/R134K/S135K)、D131G。发酵转化结果显示，过表达突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的重组酿酒酵母对底物孕酮的C14α
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羟化特异性明显提高，为研究开发绿色高效孕酮C14α
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羟化工艺奠定了坚实的基础。

技术实现思路
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[0006]针对现有甾体孕酮羟化产物特异性不高的现状，本专利技术的第一个目标是利用分子操作技术构建重组表达载体，在酿酒酵母中进行异源表达，筛选出C14α
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高羟化特异性的突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G。
[0007]本专利技术所述的CYP5103B5基因来源于新月弯孢霉。
[0008]本专利技术未定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术中突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0010]本专利技术中突变体D131G氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，以上序列属于本专利技术的保护范围。
[0011]利用本专利技术所述的编码C14α
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羟化酶的基因CYP5103B5所构建的表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，所使用的扩增引物序列、针对基因片段CYP5103B5定点突变所涉及氨基酸位点也属于本专利技术的保护范围。
[0012]本专利技术所述的经定点突变技术获得的突变基因CYP5103B5编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母等宿主细胞内表达。
[0013]有益效果：
[0014]通过重组酵母菌突变体甾体转化实验，获得高羟化特异性C14α
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羟化酶突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)和D131G，对甾体孕酮的转化特异性显著高于基因野生型菌株，本专利技术的研究成果具有重要的商业应用价值。并且重组酿酒酵母孕酮C14α
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羟化工程菌的构建为研究开发高效孕酮C14α
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羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。
[0015]说明书附图：
[0016]图1孕酮的C14α
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羟基化反应
[0017]图2基因片段CYP5103B5琼脂糖凝胶电泳验证图
[0018]其中：M为DNAMarker；
[0019]图3pYES2
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CYP5103B5重组表达载体构建图
[0020]图4pYES2
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CYP5103B5重组表达载体质粒酶切验证图
[0021]图5基因重组菌突变体Y10(S129A/T13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.C14α
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羟化酶基因突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO：1所示的序列基础上进行突变，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示，其相应的DNA序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示。2.权利要求1所述的C14α
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羟化酶基因突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G其特征在于，用于转化甾体孕酮生产14α<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，乔江羽，路福平，毛淑红，王硕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：