一种具有宽底物谱的将羧酸专一转化为手性β-羟基羧酸的人工酶制造技术

本发明专利技术公开了一种将羧酸转化为β

【技术实现步骤摘要】
一种具有宽底物谱的将羧酸专一转化为手性
β
‑
羟基羧酸的人工酶


[0001]本专利技术涉及一种利用过氧化氢作为氧化剂将羧酸转化为β
‑
羟基羧酸的人工酶，属于蛋白质工程领域。

技术介绍

[0002]β
‑
羟基羧酸是一类重要的化合物。含有10
‑
14个碳原子的β
‑
羟基羧酸(C10
‑
C14)具有天然的除草和抗真菌特性。当与氨基酸或碳水化合物结合时，它们可以创造出更多具有结构复杂性和生物学意义的天然产物，如抗生素、具有杀虫效果和免疫调节活性的有机化合物。β
‑
羟基羧酸还可以作为合成二醇、β
‑
氨基酸、β
‑
内酯、β
‑
内酰胺、双环庚酮和多羟基烷酸酯的合成前体，它们在天然产物合成、药物发现和生物材料中有着更多的应用。因此，β
‑
羟基羧酸的制备受到了广泛的关注。
[0003]常用的合成β
‑
羟基羧酸的化学方法包括线性醛的不对称aldol反应，Reformatsky反应和β
‑
酮基羧酸的不对称氢化反应，通常需要过渡金属和复杂的催化配体或化学计量的手性助剂。酮还原酶还可以不对称地还原β
‑
酮基羧酸，提供酶促途径获得手性β
‑
羟基羧酸。
[0004]在前期的研究中，通过工程化P450
BSβ
变体(P450
BSβr/>‑
L78A/Q85A/V170I/G290I)对生物可用脂肪酸进行β
‑
C
‑
H氧化官能化。尽管这是一种直接、分步经济且生态友好的反应，具有优异的区域选择性和对映选择性，但可接受的底物仅限于链长超过10个碳原子的脂肪酸，妨碍其在β
‑
羧酸合成中的广泛应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有的技术缺陷，提供一种利用过氧化氢作为氧化剂将羧酸转化为β
‑
羟基羧酸的人工酶，制备的羧酸β
‑
羟基酶P450
BSβ
突变体催化产生β
‑
羟基羧酸，将底物范围扩大至C6‑
C
20
链长的天然直链饱和脂肪酸、油酸、亚油酸以及带有不同官能团的非天然羧酸。该专利技术具有反应活性高、高区域和对映体选择性、底物范围广、体系简单、合成效率高和成本低廉等优势。
[0006]本专利技术通过对P450
BSβ
羟基化酶的定向进化实现了对羧酸的未活化β位C
‑
H键的高度区域和对映选择性地氧化。获得的P450
BSβ
羟基化酶突变体能够直接使用廉价的过氧化氢作为氧化剂，以C6
‑
C20链长的天然直链饱和脂肪酸、天然不饱和脂肪酸(油酸或亚油酸)以及含有烯烃、炔烃、溴、胺、腈、酯、二羟基、环戊基、呋喃、吡咯、苯甲氧基(邻位、间位、对位)、氟苯基、氯苯基、苯甲酰甲氧基等不同官能团的非天然羧酸为底物生成R型手性的β
‑
羟基羧酸。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体，含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0008]本专利技术还提供编码上述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]本专利技术还提供包含上述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的核苷酸序列的载体。
[0010]本专利技术还提供表达上述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的基因工程菌。
[0011]本专利技术还提供一种获得羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的方法，野生型羧酸羟基化酶P450
BSβ
，将第78位的亮氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变组氨酸，将第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，所述野生型的P450
BSβ
序列如SEQ ID NO:3所示。
[0012]本专利技术还提供一种羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0013]构建表达野生型羧酸羟基化酶P450
BSβ
的质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌中；
[0014]通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化羧酸β位C
‑
H基团的P450
BSβ
突变体的突变质粒；
[0015]羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的表达及纯化。
[0016]一种羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的获得及制备方法，包括以下步骤：
[0017](1)构建表达野生型羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
的质粒：将SEQ ID NO:4核苷酸序列经酶切重组到表达载体上，并将该质粒转化到大肠杆菌中；
[0018](2)通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化(羟基化)羧酸β位C
‑
H基团的P450
BSβ
突变体的突变质粒；
[0019](3)羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的表达：将步骤(2)得到的菌种在LB液体培养基(Kan/Cam)中过夜培养，加入TB液体培养基(Kan/Cam)扩培，于对数生长期内加入血红素前体δ
‑
氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
[0020](4)含有羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤(3)中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
[0021](5)羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的纯化：将步骤(4)的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱内，使带有His标签的目的蛋白与镍离子结合，然后用较低浓度的咪唑除去杂蛋白，最后用高浓度咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，将洗脱下来的目的蛋白透析除去咪唑，测定目的蛋白浓度后，
‑
80℃保存。
[0022]本专利技术还提供一种β
‑
羟基羧酸的制备方法，以C6
‑
C20链长的天然直链饱和脂肪酸、天然不饱和脂肪酸以及非天然羧酸作为底物，加入过氧化氢作为氧化剂，再加入反应缓冲液，用上述的羧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体，其特征在于，含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。2.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.如权利要求1所述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的制备方法，其特征在于，将野生型的P450
BSβ
第78位的亮氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变组氨酸，将第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，所述野生型的P450
BSβ
序列如SEQ ID NO:3所示。4.如权利要求1所述羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达野生型羧酸羟基化酶P450
BSβ
的质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌中；通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化羧酸β位C
‑
H基团的P450
BSβ
突变体的突变质粒；羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的表达及纯化。5.根据权利要求4所述的羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的制备方法，其特征在于，羧酸β
‑
羟基化酶P450
BSβ
突变体的表达及...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜庆，张腾飞，章昆，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：