一种美迪紫檀素的生物合成方法技术

本发明专利技术公开了一种利用合成生物学技术在酿酒酵母体内异源合成天然高价值活性化合物美迪紫檀素的方法，本发明专利技术利用生物信息学分析、挖掘，体内和体外实验鉴定，验证了美迪紫檀素生物合成相关的12个关键酶基因——肉桂酸

【技术实现步骤摘要】
一种美迪紫檀素的生物合成方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术是有关于在微生物酿酒酵母中生物合成美迪紫檀素的一种方法。

技术介绍

[0002]美迪紫檀素是存在于甘草、黄花草木犀、天山岩黄芪、苦马豆、苜蓿等豆科植物中的一种稀有黄酮类化合物，研究表明美迪紫檀素在抗肿瘤方面具有较好的活性。目前获取美迪紫檀素的方法主要是从植物中直接提取或化学合成。从植物中获取美迪紫檀素需要消耗大量的原植物，过量采挖破坏生态环境，造成植物资源严重匮乏；而化学合成美迪紫檀素这一方法存在步骤繁琐、产率低、环境不友好等问题。因此，寻找合理、高效获取美迪紫檀素的新方法亟不可待。
[0003]近年来，合成生物学发展迅速，利用微生物酵母细胞工厂合成稀有高价值药效成分，已成为生产药物和开发新药的重要途径之一。微生物生长周期短，可用多种糖类原料大规模生产，相对于植物种植提取和化学合成而言，用微生物发酵生产美迪紫檀素是一种经济高效的方式，是一种新型的绿色生物制造模式。因此利用合成生物学方法构建美迪紫檀素的酿酒酵母微生物细胞工厂，将有效解决美迪紫檀素的资源可持续利用问题。
[0004]本专利技术利用生物信息学分析、挖掘，体外和体内实验鉴定，验证了美迪紫檀素生物合成相关的12个关键酶基因——肉桂酸
‑4‑
羟化酶(C4H)、香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮还原酶(CHR)、查尔酮异构酶(CHI)、2
‑
羟基异黄酮合成酶(2
‑
HIS)、2r/>‑
羟基异黄酮脱水酶(HID)、异黄酮
‑4′‑
O
‑
甲基转移酶(HI4
′
OMT)、异黄酮
‑2′‑
羟化酶(I2′
H5)、异黄酮还原酶(IFR4)、雌激素还原酶(VR)、紫檀碱合成酶(PTS)，以这些关键酶基因作为美迪紫檀素的表达元件，构建酿酒酵母细胞工厂异源合成美迪紫檀素。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，在现有技术的基础上，筛选出一种经济高效、绿色环保的方法，即利用酿酒酵母细胞工厂异源合成具有抗癌活性的化合物——美迪紫檀素。
[0006]本专利技术申请发现，酿酒酵母中异源生物合成途径的表达和优化需要在多个不同位点引入多个(连续的)基因，应用CRISPR
‑
Cas9系统可以加快酿酒酵母菌株的构建。在8个酿酒酵母整合位点进行切割的CRISPR
‑
Cas9质粒。将含有CHS、CHI、CHR三个查尔酮合成过程相关酶的基因表达模块1、含有IFR4和I
′2H5的基因表达模块2、依次成功转化进入酿酒酵母IMX581，并分别获得酿酒酵母菌株DW
‑
01、DW
‑
02。以DW
‑
02菌株为出发菌株，转化含有PTS和VR基因的表达模块3至相应酿酒酵母整合位点，获得菌株DW
‑
03(表1)，培养DW
‑
03菌，破菌后提取粗蛋白，以芒柄花黄素为底物，UPLC检测其基因表达产物，实验发现有美迪紫檀素的产生。接着以DW
‑
03菌株为出发菌株，转化含有2
‑
HIS、HID基因的表达模块4和含有C4H、4CL的基因表达模块5至相应酿酒酵母整合位点，分别获得菌株DW
‑
04、DW
‑
05(表1)。以甘草素为底物饲喂DW
‑
04，UPLC检测其基因表达产物，发现有黄豆苷元的产生。为增加P450酶I
′2H5、2
‑
HIS的表达强度，在DW
‑
04的基础上又增加了I
′2H5、2
‑
HIS的拷贝数和P450酶的氧化还原伙伴CPR，成功构建了菌株DW
‑
06。接下来，以DW
‑
06为底盘，转入含有HI4
′
OMT的外源模块7，以验证以甘草素为底物，经过2
‑
HIS、HI4
′
OMT、HID关键酶催化表达后合成芒柄花黄素，继而合成美迪紫檀素。
[0007]一种美迪紫檀素的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008](1)构建酵母菌株DW
‑
01(见表1)，异甘草素在该酵母菌株中异源表达的查尔酮异构酶作用下可获得化合物1—甘草素，结构式如下：
[0009][0010](2)构建酵母菌株DW
‑
04(见表1)，甘草素在该酵母菌株中异源表达的2
‑
羟基异黄酮合成酶和2
‑
羟基异黄酮脱水酶作用下可获得化合物2—黄豆苷元，结构式如下：
[0011][0012](3)构建酵母菌株DW
‑
07(见表1)，黄豆苷元在该酵母菌株中异源表达的异黄酮
‑4′‑
O
‑
甲基转移酶作用下获得化合物3—芒柄花黄素，结构式如下：
[0013][0014](4)构建酵母菌株DW
‑
02、DW
‑
03和DW
‑
06(见表1)，芒柄花黄素在中这些酵母菌株中异源表达的异黄酮
‑2′‑
羟化酶、异黄酮还原酶、雌激素还原酶和pterocarpansynthase作用下获得化合物美迪紫檀素，其结构式如下：
[0015][0016]本专利技术提供的美迪紫檀素合成相关酿酒酵母菌株构建方法如下表1所示：
[0017]表1美迪紫檀素合成相关酿酒酵母菌株构建
[0018][0019][0020]注：表中所述基因依次为：CHS(chalcone synthase)查尔酮合成酶；CHI(chalcone isomerase)查尔酮异构酶；CHR(chalcone reductase)查尔酮还原酶；I2'H5(isoflavone 2'
‑
hydroxylase)异黄酮
‑2′‑
羟化酶；IFR4(isoflavone reductase)异黄酮还原酶；GePTS(Glycyrrhiza echinata pterocarpan synthase)紫檀碱合成酶；VR(vestitone reductase)雌激素还原酶；2
‑
HIS(2
‑
hydroxyisoflavanone)2
‑
羟基异黄酮合成酶；HID(2
‑
hydroxyisoflavanone dehydratase)2
‑
羟基异黄酮脱水酶；C4H(cinnamate 4
‑
hydroxylase)肉桂酸羟化酶；4CL(4
‑
coumarate CoA ligase)4
‑
香豆酰辅酶A连接酶；GmCPR(soybean cytochrome P4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种美迪紫檀素的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建酵母菌株DW
‑
01，异甘草素在该酵母菌株中异源表达的查尔酮异构酶作用下可获得化合物1—甘草素，结构式如下：(2)构建酵母菌株DW
‑
04，甘草素在该酵母菌株中异源表达的2
‑
羟基异黄酮合成酶和2
‑
羟基异黄酮脱水酶作用下可获得化合物2—黄豆苷元，结构式如下：(3)构建酵母菌株DW
‑
07，黄豆苷元在该酵母菌株中异源表达的异黄酮
‑4′‑
O
‑
甲基转移酶作用下获得化合物3—芒柄花黄素，结构式如下：(4)构建酵母菌株DW
‑
02、DW
‑
03和DW
‑
06，芒柄花黄素在这些酵母菌株中异源表达的异黄酮
‑2′‑
羟化酶、异黄酮还原酶、雌激素还原酶和pterocarpan synthase作用下获得化合物美迪紫檀素，其结构式如下：2.根据权利要求1所述的一种美迪紫檀素的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)异甘草素在查尔酮异构酶的催化下异构成甘草素酶反应体系为：1M/L缓冲液HEPES15μL，10mg/mL底物异甘草素7.7μL，49.81mg/mL的查尔酮异构酶30μL，超纯水补至300μL，混匀；于水浴锅中反应过夜后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液后离心浓缩至干，后加甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，得甘草素；(2)甘草素在2
‑
羟基异黄酮合成酶(2
‑
HIS)、2
‑
羟基异黄酮脱水酶(HID)的催化下生成黄豆苷元
酶反应体系为：0.2M K2HPO4，1.25mM GSH，50％蔗糖，1mM还原型辅酶Ⅱ(NADPH)组成的酶反应液400μL,10mg/mL底物甘草素2.5μL，70mM/L还原型辅酶Ⅰ(NADH)15μL，1M/L的MgCl25μL，2
‑
羟基异黄酮合成酶430μL和2
‑
羟基异黄酮脱水酶50μL，超纯水补至300μL，混匀；于水浴锅中反应过夜后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液后离心浓缩至干，后加甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，得黄豆苷元；(3)黄豆苷元在异黄酮
‑4′‑
O
‑
甲基转移酶(HI4
′
OMT)的催化下生成芒柄花黄素酶反应体系为：pH 7.5，1M/L的Tris
‑
HCl60μL，55mM/L的β
‑
巯基乙醇76μL，0.5M/L的EDTA3μL，10mM/L的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)30μL，10mg/mL的底物黄豆苷元1.2μL，10mM/L的S
‑
腺苷甲硫氨酸(SAM)14μL，异黄酮
‑4′‑
O
‑
甲基转移酶30μL，超纯水补至300μL，混匀；于水浴锅中反应过夜后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液后离心浓缩至干，后加甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，得芒柄花黄素；(4)芒柄花黄素在异黄酮
‑2′‑
羟化酶(I2′
H5)、异黄酮还原酶(IFR4)、雌激素还原酶(VR)及pterocarpan synthase(PTS)催化下生成美迪紫檀素酶反应体系为：1M/L的K3PO4100μL，2M/L的蔗糖192.5μL，1M/L的GSH0.5μL，10mM/L的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)200μL，10mM/L的还原型辅酶Ⅰ(NADH)200μL，1M/L的MgCl25μL，10mg/mL底物芒柄花黄素1.2μL，粗酶液250μL，超纯水补至300μL；混匀，于水浴锅中反应过夜；芒柄花黄素能在异黄酮
‑2′‑

【专利技术属性】
技术研发人员：林炜，赵明，魏勇军，路楚洁，杜瑞，林兆柱，陈培英，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：