一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法技术

本发明专利技术公开一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法，通过花斑曲霉(Aspergillus versicolor)CCTCC NO:M2022064的发酵培养和发酵产物的提取分离，获得高产率、高纯度吲哚二酮哌嗪生物碱Brevianamide K，使得Brevianamide K产率达到2.7g/kg大米，纯度达到98.61％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度Brevianamide K的制备难题，保障后续以Brevianamide K为先导的创新药物研制具有重要意义。要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法
(一)

[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种吲哚二酮哌嗪类生物碱Brevianamide K的制备。
(二)
技术介绍

[0002]二酮哌嗪是由两个氨基酸通过肽键缩合而成的环肽类结构，因其稳定的六元环骨架结构使其成为一个重要的药效团，表现出了抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、神经保护、抗疟疾、抗高血糖等多种生物活性。
[0003]Brevianamide K是一种吲哚二酮哌嗪生物碱，呈黄色针状晶体，分子式为C
21
H
21
N3O2，相对分子质量为347，熔点157
‑
158℃，其化学结构如式(I)所示。
[0004][0005]Brevianamide K具有显著的体外α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性(IC
50
＝7.60μM)(Ye G.T.et al.,Marine Drugs,2021,19,402)，且对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B(mPTPB)具有显著的抑制活性(IC
50
＝7.07μM)(佘志刚等.海洋真菌来源的哌嗪类衍生物及其在制备抗结核药物中的应用.公开号:CN104230938A；公开日:2014.12.24)，展现出了被开发成为糖尿病和结核病治疗药物的巨大潜力。Brevianamide K于2009年首次从杂色曲霉Aspergillus versicolorA.3.4186次级代谢产物中发现。目前，现有文献报道的Brevianamide K制备方法均为曲霉发酵法，包括液体发酵和固体发酵。其中，液体发酵法制备的最高产率为0.383mg/L(Kong X.L.et al.,J.Ocean Univ.China,2014,13,691
‑
695)，而固体发酵的最高产率为67.5mg/kg大米(Li G.Y.et al.,Org.Lett.,2009,11,3714
‑
3717.)。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法，该方法另辟蹊径，采用特殊生境真菌——花斑曲霉(Aspergillusversicolor)CCTCC NO:M2022064，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，获得高产率、高纯度Brevianamide K，解决了现有技术中产率低的缺陷。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种吲哚二酮哌嗪生物碱(Brevianamide K)的制备方法，所述制备方法为：(1)将花斑曲霉(Aspergillusversicolor)ZJUTE2接种至大米固体培养基，在20
‑
30℃条件下暗培养15
‑
30天，获得大米发酵产物；所述花斑曲霉ZJUTE2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2022064，地址为中国，武汉，武汉大学；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计
为1
‑
5mL/g(优选1.35mL/g)；(2)将大米发酵产物(优选捣碎)中加入有机溶剂，室温(25
‑
30℃)浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析(优选直径d＝4cm，高h＝60cm)，以体积浓度30
‑
100％甲醇
‑
水为洗脱液，收集体积浓度70
‑
80％的甲醇
‑
水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，即得到式(Ⅰ)所示Brevianamide K；
[0009][0010]优选的，步骤(1)所述花斑曲霉ZJUTE2接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1
‑
1％(优选1％)的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将花斑曲霉ZJUTE2接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，28℃培养7天，使菌株活化，将活化后的菌株用含体积浓度2％吐温80的无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1
×
105‑1×
108个/mL，优选1
×
106个/mL；所述PDA培养基组成为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
[0011]优选的，步骤(1)中发酵培养条件为：28℃条件下暗培养20天。
[0012]优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2～8mL/g(优选5
‑
6mL/g)；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天，每次浸提用的有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为4mL/g。
[0013]优选的，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2
‑
5mL/g(优选3.1mL/g)；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5
‑
3；萃取3
‑
5次，每次萃取用的有机溶剂与水体积比优选1:1。
[0014]优选的，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速10
‑
20mL/min(优选15mL/min)；收集体积比70:30
‑
80:20的甲醇
‑
水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；所述甲醇体积用量以萃取物浸膏质量计为1
‑
5mL/g，优选2mL/g。
[0015]优选的，步骤(5)甲醇体积用量以浓缩物质量计为20
‑
30mL/g(优选26
‑
27mL/g)。
[0016]与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
[0017]本专利技术利用花斑曲霉ZJUTE2的发酵培养，高产率制备高纯度Brevianamide K，使得Brevianamide K产率达到2.7g/kg大米，纯度达到98.61％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度Brevianamide K的制备难题，为后续新型抗结核药物的研发提供化学实体具有较大意义。
(四)附图说明
[0018]图1是Aspergillusversico本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吲哚二酮哌嗪生物碱的制备方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：(1)将花斑曲霉(Aspergillus versicolor)ZJUTE2接种至大米固体培养基，在20
‑
30℃条件下暗培养15
‑
30天，获得大米发酵产物；所述花斑曲霉ZJUTE2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2022064，地址为中国，武汉，武汉大学；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1
‑
5mL/g；(2)将大米发酵产物中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏用甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，以体积浓度30
‑
100％甲醇
‑
水为洗脱液，收集体积浓度70
‑
80％的甲醇
‑
水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物用甲醇溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，即得到式(Ⅰ)所示吲哚二酮哌嗪生物碱；2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述花斑曲霉ZJUTE2接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1
‑
1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将花斑...

【专利技术属性】
技术研发人员：应优敏，冉坤，单伟光，李敏，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：