一种发酵生产腺嘌呤的方法技术

本发明专利技术提供了一种发酵生产腺嘌呤的方法，采用混菌发酵法生产腺嘌呤能使腺苷酶解之后产生的D

A method of producing adenine by fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产腺嘌呤的方法


[0001]本专利技术涉及微生物及发酵工程
，尤其是一种发酵生产腺嘌呤的方法。

技术介绍

[0002]腺嘌呤又称6
‑
氨基嘌呤，是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的一种碱基，缩写为A。在脱氧核糖核酸中，它与胸腺嘧啶(T)配对。在核糖核酸中，它与尿嘧啶(U)配对。旧称维生素B4。腺嘌呤在生物化学上也具有许多不同的功用。于细胞呼吸中，是以富有能量的腺苷三磷酸(ATP)，以及辅因子Chemicalbook烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等形式发生作用；在蛋白质生物合成过程里作为DNA与RNA的组成物。目前腺嘌呤的生产方法是通过酶解腺苷生产腺嘌呤，利用此方法生产腺嘌呤会产生大量的D
‑
核糖，对后期腺嘌呤的提取造成极大的困难。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种发酵生产腺嘌呤的方法。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0005]一种发酵生产腺嘌呤的方法，分别培养腺苷水解酶工程菌BL21
‑
ADH与腺苷枯草芽孢杆生产菌XGL，并用超声对BL21
‑
ADH发酵液进行超声处理，最后在枯草芽孢杆菌XGL发酵至中后期时混合经超声处理的BL21
‑
ADH培养液，使枯草芽孢杆菌XGL发酵生产的腺苷转化为腺嘌呤，并分别在混合培养之后分两阶段分别进行两次膜透析操作，使透析液排出、浓缩菌体回流至罐中继续发酵，并分别在其透析后补加60％枯草芽孢杆菌XGL发酵培养基，使其继续发酵生产。
[0006]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述BL21
‑
ADH培养4h时添加诱导剂IPTG，之后培养至10h时进行超声处理。
[0007]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述枯草芽孢杆菌XGL的具体培养步骤如下：
[0008](1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌XGL从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在34℃；
[0009](2)种子培养：将无菌水(200mL左右)于超净台火焰附近倒入茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程pH维持在6.7
‑
7.0，温度维持在34℃，溶氧维持在35
‑
50％；
[0010](3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期pH维持在6.7
‑
7.0，发酵中后期(菌体OD生长缓慢)发酵pH维持在6.4
‑
6.7，温度维持在34℃，溶氧维持在30％
‑
50％，培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程；
[0011](4)营养物流加：发酵培养10h开始以0.3g/L/h的速率流加营养物(流加用量300mL，发酵过程中使用蠕动泵匀速流加，流加速率0.3g/L/h)，流加营养物的成分为：V
B1
、Vb3、Vb5、Vb
12
各4mg/L、V
H 1mg/L、黄嘌呤0.2mg/L、组氨酸0.7g/L、酵母粉10g/L、大豆酶解粉
30g/L。
[0012]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖2g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂粉25g/L，黄嘌呤50mg/L，组氨酸50mg/L；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，KH2PO
4 3g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精3g/L，蛋白胨5g/L，黄嘌呤200mg/L，组氨酸0.5g/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb
12
各3mg/L，V
H
2mg/L，硫酸铵8g/L，r
‑
GABA 0.2g/L，消泡剂(Defoamer消泡剂)1g/L；所述发酵培养基成分为：葡萄糖30g/L，味精12g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4·
3H2O6g/L，黄嘌呤200mg/L，组氨酸0.5g/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb
12
各5mg/L，V
H
2mg/L，CaCl22g/L，次黄嘌呤20g/L，MgSO4·
7H2O5g/L，微量元素混合液5mL/L，FeSO4·
7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，硫酸铵10g/L，r
‑
GABA0.1g/L，其中，所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·
6H2O 1.4mg/L，MnSO4·
H2O 0.5mg/L，CuSO4·
7H2O 0.5mg/L，ZnSO4·
7H2O 0.6mg/L，消泡剂1g/L，各成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
[0013]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述消泡剂为有机硅类消泡剂(Defoamer消泡剂)。
[0014]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，当枯草芽孢杆菌XGL培养至10h时开始流加营养物(流加用量300mL，发酵过程中使用蠕动泵匀速流加，流加速率0.3g/L/h)。
[0015]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述BL21
‑
ADH的具体培养步骤如下：
[0016](1)菌种活化：将BL21
‑
ADH从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在37℃；
[0017](2)菌体培养：将无菌水(200mL左右)于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程pH维持在6.7
‑
7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35
‑
50％，培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程；
[0018](3)诱导剂添加：在菌体量培养至4h时添加诱导剂IPTG，诱导腺苷水解酶的表达，IPTG按0.1mmol/L添加；
[0019](4)BL21
‑
ADH发酵液超声处理：选用功率为300W，频率为25kHz的超声棒对菌体进行处理。
[0020]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述步骤(4)中超声处理的工作方式为：工作7min，间歇3s，期间温度控制在4℃，并将处理完的菌液于4℃罐中保存，直至整体发酵结束。
[0021]优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述斜面培养基成分为：葡萄糖2g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂粉25g/L；所述菌体培养的培养基成分为：葡萄糖30g/L，酵母粉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产腺嘌呤的方法，其特征在于：分别培养腺苷水解酶工程菌BL21
‑
ADH与腺苷枯草芽孢杆生产菌XGL，并用超声对BL21
‑
ADH发酵液进行超声处理，最后在枯草芽孢杆菌XGL发酵至中后期时混合经超声处理的BL21
‑
ADH培养液，使枯草芽孢杆菌XGL发酵生产的腺苷转化为腺嘌呤，并分别在混合培养之后分两阶段分别进行两次膜透析操作，使透析液排出、浓缩菌体回流至罐中继续发酵，并分别在其透析后补加60％枯草芽孢杆菌XGL发酵培养基，使其继续发酵生产。2.根据权利要求1所述的发酵生产腺嘌呤的方法，其特征在于：所述BL21
‑
ADH培养4h时添加诱导剂IPTG，之后培养至10h时进行超声处理。3.根据权利要求1所述的发酵生产腺嘌呤的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌XGL的具体培养步骤如下：(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌XGL从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养，温度维持在34℃；(2)种子培养：将无菌水于超净台火焰附近倒入茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程pH维持在6.7
‑
7.0，温度维持在34℃，溶氧维持在35
‑
50％；(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期pH维持在6.7
‑
7.0，发酵中后期发酵pH维持在6.4
‑
6.7，温度维持在34℃，溶氧维持在30％
‑
50％，培养过程中通过流加80％m/v葡萄糖溶液维持发酵过程；(4)营养物流加：发酵培养10h开始以0.3g/L/h的速率流加营养物，流加营养物的成分为：V
B1
、Vb3、Vb5、Vb
12
各4mg/L、V
H 1mg/L、黄嘌呤0.2mg/L、组氨酸0.7g/L、酵母粉10g/L、大豆酶解粉30g/L。4.根据权利要求3所述的发酵生产腺嘌呤的方法，其特征在于：所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖2g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂粉25g/L，黄嘌呤50mg/L，组氨酸50mg/L；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，KH2PO43g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精3g/L，蛋白胨5g/L，黄嘌呤200mg/L，组氨酸0.5g/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb
12
各3mg/L，V
H 2mg/L，硫酸铵8g/L，r
‑
GABA 0.2g/L，消泡剂1g/L；所述发酵培养基成分为：葡萄糖30g/L，味精12g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4·
3H2O 6g/L，黄嘌呤200mg/L，组氨酸0.5g/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb
12
各5mg/L，V
H 2mg/L，CaCl
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，孙鹏杰，李长庚，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：