一种西罗莫司的发酵方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种西罗莫司的发酵方法，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐内培养，获取高产量西罗莫司的发酵液，所述的发酵培养基经过高强度灭菌处理；本发明专利技术的发酵工艺高压灭菌条件下使得培养基成分发生变化，并在发酵过程中补加葡萄糖和磷脂，西罗莫司在发酵液中以油状物状态在发酵液中分布，磷脂增加西罗莫司及其前体的分散，同时提高细胞膜的通透性，促进西罗莫司次级代谢途径诱导，对产物积累的反馈抑制有一定效果，从而对西罗莫司和中间体转化有较好作用。本发明专利技术西罗莫司发酵制备工艺操作简单，显著提高发酵含量。酵含量。

【技术实现步骤摘要】
一种西罗莫司的发酵方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种西罗莫司的发酵方法。

技术介绍

[0002]西罗莫司(Sirolimus)又称雷帕霉素(Rapamycin)，是一种31元大环内酯类免疫抑制剂，由吸水链霉菌、游动放线菌等菌株产生，具有广泛的生物活性，包括抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等。同时以西罗莫司为前体，化学修饰合成的一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森综合征与艾滋病等方面上，具有新的治疗作用，其中合成衍生物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物获批上市或临床研究，雷帕霉素在医药应用领域具有广泛前景。鉴于西罗莫司结构复杂，不适合化学合成，将来仍将依赖于发酵生产，因此迫切需要研发优良的生产菌株，结合发酵工艺优化提升了西罗莫司的发酵水平。随着其生物合成途径得到全面解析以及西罗莫司产生菌遗传操作体系的不断完善，为我们发展基于代谢工程理念的发酵调控提供了可能。西罗莫司的合成受到复杂的调控，一些关键前体或代谢中间体也对西罗莫司合成具有促进作用。
[0003]根据代谢途径影响专利CN109486877A采用发酵96h开始按每天批补葡萄糖水溶液，直至发酵结束。HPLC法测定发酵单位可达1000μg/ml以上。
[0004]专利CN102199638中在发酵初始培养基中添加质量浓度为0.2-1％的氨基酸，发酵产量比对照组可显著提升，但未提及具体发酵含量。其中丙氨酸的提高幅度显著低于亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等氨基酸。
[0005]姜巍等在《雷帕霉素发酵过程中流加补料的优化研究》文献中报道在发酵72h流加0.35％异亮氨酸，144h流加0.1％异亮氨酸，雷帕霉素发酵水平达到1360g/L。专利CN103555785A报道在发酵培养过程前期流加甘油和磷酸盐缓冲液，在合成期流加L-哌可酸和莽草酸，达到了在生成期减少去甲基衍生物，增加雷帕霉素含量。
[0006]CN109468253A公开了一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌，采用基因敲除使吸水链霉菌NRRL 5491缺失基因组中4083721-4085064位部分或全部序列的突变株，使得雷帕霉素的发酵产量达到了1567.27mg/L。
[0007]目前西罗莫司的发酵产量仍然较低，有目的的基因改造后的发酵含量仅达到1567.27mg/L，还有待进一步的提高。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种高产量西罗莫司的发酵方法，该方法调控操作简单，发酵单位显著提高，同时提高了关键中间体29-O-去甲基西罗莫司的转化率，为分离纯化提供了便利，为提高产品国际竞争力提供了保障。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种高产量西罗莫司的发酵方法，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐内培养，获取高产量西罗莫司的发酵液；所述的发酵培养基经过高强度灭菌处理。
[0011]优选地，所述的高强度灭菌处理是指发酵培养基在125～130℃下灭菌。
[0012]优选地，所述发酵培养基的灭菌时间为30-60min。
[0013]优选地，补料过程包括补加葡萄糖过程。
[0014]优选地，补加葡萄糖质量与发酵体系初始体积比为10～20g/L；其中葡萄糖的质量以g计，发酵体系初始体积以L计。
[0015]优选地，发酵过程中定时检测发酵体系还原糖的含量，当还原糖低于1g/L时补加葡萄糖。
[0016]优选地，每次补加葡萄糖的量为1～3g/L，其中补加葡萄糖的质量以g计，发酵液体积以L计。
[0017]优选地，补料葡萄糖经过115～121℃、灭菌20～30min。
[0018]优选地，所述的发酵过程还包括补加磷脂过程。
[0019]优选地，发酵过程中补加磷脂的质量与发酵液体积比为1～3g/L，其中磷脂的质量以g计，发酵液体积以L计。
[0020]优选地，所述的补加磷脂的过程在发酵前期和/或中期补加，进一步优选地，在发酵开始后的第66～78h和第114～126h补加。
[0021]优选地，发酵过程中体系的pH为6.0～6.9，进一步优选pH6.0～6.4。
[0022]优选地，发酵培养基为：玉米淀粉10-25g/L、黄豆饼粉5-15g/L、蛋白胨5-10g/L、玉米浆干粉5-10g/L、甘油5-15g/L、葡萄糖20-40g/L、哌啶-2-甲酸3-5g/L、K2HPO
4 2-5g/L、KH2PO
4 2-5g/L、MgSO4
·
7H2O 0.02-0.06g/L、碳酸钙2-5g/L和泡敌2-5g/L，pH为6.5-7.0。
[0023]进一步优选地，发酵基础培养基为：玉米淀粉13g/L、黄豆饼粉10g/L、蛋白胨6g/L、玉米浆干粉5g/L、甘油10g/L、葡萄糖35g/L、哌啶-2-甲酸3g/L、K2HPO
4 3g/L、KH2PO
4 3g/L、MgSO4
·
7H2O 0.05g/L、碳酸钙3g/L和泡敌3g/L，pH为6.9。
[0024]优选地，发酵过程中，发酵条件为培养温度为28～30℃，维持罐压0.05～0.07Mpa，通气量为1.4～2.0m3/h，转速100rpm-400rpm，溶氧控制在20-30％，pH为6.0～6.9，培养时间为216-264h。
[0025]优选地，以游动放线菌Actinoplanes sp.N902-109作为发酵菌种。
[0026]优选地，所述的发酵过程是将种子液按照8～12％v/v的接种量接入液体发酵培养基中。
[0027]以下内容将详细阐述西罗莫司的发酵方法，包括如下步骤：
[0028](1)菌种活化：将菌种接种于斜面培养基上，于28～30℃的生化培养箱中培养5～8天，待斜面完全被孢子覆盖，色泽呈红褐色，形态饱满待用。
[0029](2)一级种子液制备：用接种铲从已培养好的西罗莫司产生菌斜面上取一环接种至装有种子培养基的锥形瓶中，摇床转速为200～220r/m，温度为28～30℃，培养44～48h。
[0030](3)二级种子液制备：按照8～12％的接种量将一级种子培养液接种至装有二级种子培养基的锥形瓶中，摇床转速为200～220r/m，温度为28～30℃，培养20～30h。
[0031](4)种子罐培养：按照1～3％接种量将二级种子培养液接种至装有种子培养液的种子罐中，转速80～100rpm，培养16～24h，培养温度28～30℃，通气量0.7～1.4m3/h，罐压0.05～0.1Mpa。
[0032](5)发酵罐培养：将种子罐种子培养液按照8～12％的接种量接入装有发酵培养基
的发酵罐中，培养温度28～30℃，维持罐压0.05～0.07Mpa，通气量1.4～2.0m3/h，转速100rpm-400rpm，溶氧控制在20-30％，在发酵过程维持pH6.0-6.9，发酵过程中实时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种西罗莫司的发酵方法，包括将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐内培养，获取高产量西罗莫司的发酵液；其特征在于，所述的发酵培养基经过高强度灭菌处理。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述的高强度灭菌处理是将发酵培养基在125～130℃下灭菌。3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，灭菌时间为30～60min。4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵方法，其特征在于，发酵过程中补加葡萄糖。5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，补加葡萄糖质量与发酵体系初始体积比为10～20g/L；其中葡萄糖的质量以g计，发酵体系初始体积以L计。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：马印虎，朱兵峰，刘存磊，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：