单胺氧化酶在制备托品酮中的应用制造技术

本发明专利技术公开了单胺氧化酶在制备托品酮中的应用，属于酶催化和合成生物学技术领域。本发明专利技术提供的单胺氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术提供了该酶在制备托品酮中的应用，通过催化4

【技术实现步骤摘要】
Communications,2019,10,4036；Ping,Y.et al.Building Microbial Hosts for Heterologous Production of N
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Methylpyrrolinium.[J].ACS Synthetic Biology,2019,8,257
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263；Ping,Y.et al.De Novo Production of the Plant
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Derived Tropine and Pseudotropine in Yeast.ACS Synthetic Biology,2019,8,1257
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1262；CN 111826355 A)。已有研究表明，无论在植物还是微生物代谢工程中，托品酮生物合成均是托品烷类天然产物生物合成的关键限速步骤，极大地限制了下游药用托品烷生物碱的积累。而托品酮生物合成的最关键的限速步骤就是细胞色素P450介导的催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸形成托品酮这一步。植物的P450为膜蛋白，具有表达量低下、不够稳定，以及难以利用酶工程改造等缺陷，因此发展一个更高效的将4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸转化成托品酮的生物催化反应，将是提高托品酮的生物合成产量，进而实现托品类药物微生物生产的突破性技术。基于上述背景，本专利技术创新性利用单胺氧化酶替代传统的细胞色素P450酶，从而实现了4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸到托品酮的转化，为托品类药物微生物生产工艺的发展提供新的路线。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对托品酮生物合成的限速步骤——细胞色素P450介导4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸到托品酮的转化所存在的问题，提供一种单胺氧化酶在制备托品酮中的应用。本专利技术利用筛选的单胺氧化酶作为生物催化剂可用于替代P450酶催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸的环合反应，于托品类药物微生物生产具有较好的应用价值。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种单胺氧化酶在制备托品酮中的应用，所述的单胺氧化酶具有催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸转化成托品酮的活性(图1)，其能够生物转化或体外催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸转化成托品酮。将单胺氧化酶的编码基因导入微生物体内进行异源表达，通过生物转化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸形成托品酮，或从微生物体内纯化出单胺氧化酶，加入辅因子FAD和/或过氧化酶，通过体外酶学催化方式催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸形成托品酮。
[0008]所述的单胺氧化酶包括但不局限于下述蛋白质：
[0009](1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
[0010](2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的蛋白质；
[0011](3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上同源性的蛋白质，优选地95％以上同源性，更优选地98％以上同源性。
[0012]一种上述单胺氧化酶的编码基因在制备托品酮中的应用。其中，上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的单胺氧化酶的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
[0013]一种含有上述单胺氧化酶的编码基因的重组质粒在制备托品酮中的应用。所述的重组质粒转化到微生物体内能够异源表达上述单胺氧化酶。
[0014]一种含有上述重组质粒的重组菌株在制备托品酮中的应用。所述的重组菌株为能够异源表达上述单胺氧化酶的生物细胞，所述的生物细胞包括但不局限于大肠杆菌、酵母。
[0015]本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术筛选出具有特异催化活性的单胺氧化酶作为生物催化剂，用于4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸到托品酮的转化，使得该步合成效率相较于P450催化的环合反应有了显著提升，解决了托品酮生物合成的限速步骤，具有较高的应用价值。
附图说明
[0016]图1：单胺氧化酶催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸(式I)生成托品酮(式II)反应；
[0017]图2：托品酮传统微生物合成途径以及本专利技术途径；
[0018]图3：单胺氧化酶体外表达的蛋白胶图；
[0019]图4：单胺氧化酶催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸生成托品酮的LC
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MS检测结果图。
具体实施方式
[0020]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，分子生物学实验包括蛋白表达，培养基和试剂配制等等，如无特殊说明，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。
[0021]本专利技术中涉及菌株：大肠杆菌(Escherichia coli BL21)购自北京全式金生物技术有限公司、单胺氧化酶基因序列(SEQ ID NO.2所示)合成及单胺氧化酶表达质粒pET28a
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MAO
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N构建由金唯智生物科技有限公司完成。
[0022]LB培养基：酵母浸粉0.5g、胰蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、去离子水100mL；
[0023]LA培养基：酵母浸粉0.5g、胰蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、琼脂2.0g、去离子水100mL；
[0024]M9培养基：1M硫酸镁溶液2mL、1M氯化钙溶液100mL、七水磷酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单胺氧化酶在制备托品酮中的应用，其特征在于：所述的单胺氧化酶能催化4
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甲基
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吡咯烷基)
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氧代丁酸转化成托品酮；所述的单胺氧化酶包括下述蛋白质：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的蛋白质；(3)与SEQ ID NO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿旭东，林芝，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：