一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种7

【技术实现步骤摘要】
一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法。

技术介绍

[0002]雷帕霉素(西罗莫司)是1975年由Veniza等分离得到的吸水链霉菌所产的大环内脂类抗生素。经过多年的研究，雷帕霉素已开发成为临床使用的强效免疫抑制剂。同时以雷帕霉素为前体，化学修饰合成的一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森综合征与艾滋病等方面上具有新的治疗作用，其中合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物进行临床研究，雷帕霉素在医药应用领域具有广泛前景。
[0003]吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)在发酵过程中除产生主产物西罗莫司外，同时还合成一些西罗莫司同系物。例如西罗莫司产生菌在生物合成西罗莫司的过程中，由聚酮合酶和非核糖体肽合成酶首先合成西罗莫司骨架——前西罗莫司(pro-rapamycin)，其多个位点(如C-7、C-29位)为羟基，然后，由甲基转移酶将甲硫氨酸的甲基转移到前西罗莫司的如C-7位或C-29位的羟基上，形成7-O-去甲基雷帕霉素或29-O-去甲基雷帕霉素。由于西罗莫司同系物结构与西罗莫司类似，在生产中不易分离，因此成为西罗莫司成品中杂质的主要来源。
[0004]杨国新，陈夏琴等报道了吸水链霉菌FC-904发酵代谢产物29-O-去甲基雷帕霉素的分离和结构鉴定，西罗莫司发酵粗提液中29-O-去甲基雷帕霉素含量达到1.1％(参见中国抗生素杂志2019年2月第44卷第2期)。陈夏琴，杨国新等报道了西罗莫司类似物7-O-去甲基雷帕霉素的分离和机构鉴定，7-O-去甲基雷帕霉素在发酵液中的含量约为5％(参见中国抗生素杂志2016年4月第41卷第4期)。现有技术对雷帕霉素的合成方法有大量报道，但是针对7-O-去甲基雷帕霉素的生物合成方法却鲜有报道，雷帕霉素发酵液中7-O-去甲基雷帕霉素的含量较低，为研究该杂质带来不便。因此需要提供一种针对7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法显得非常有必要。

技术实现思路

[0005]基于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法，该方法调控操作简单，发酵周期短，定向制备7-O-去甲基雷帕霉素收率高、为研究雷帕霉素的相关杂质提供了便利。
[0006]现有技术针对雷帕霉素同系物的现有报道工艺，来源途径主要包括生物代谢合成和化学合成两种，本专利技术以游动放线菌(Actinoplanes)为出发菌种，通过不同种类助溶剂、不同氨基酸对应不同周期添加的选择，经摇瓶发酵或发酵罐发酵实现了提高7-O-去甲基雷帕霉素的生物合成产量。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法，以游动放线菌(Actinoplanes)作为发酵菌种，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产7-O-去甲基雷帕霉
素，在发酵24h后开始分批次补加补料培养基，至发酵结束。
[0009]优选地，所述的补料培养基为助溶剂和氨基酸。
[0010]优选地，所述的补料培养基为6～15g/L助溶剂与1～3g/L氨基酸。
[0011]优选地，所述的助溶剂为有机硅型消泡剂、聚醚型消泡剂或聚醚改性有机硅型消泡剂；进一步优选所述助溶剂为SAG630，泡敌DF-104，聚醚硅消泡剂SKS-GM-1。
[0012]优选地，所述的氨基酸为L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸中的一种或其组合。
[0013]优选地，所述补料培养基的加入量为发酵液体积的10～20％。
[0014]优选地，所述补料培养基的加入方式为分阶段一次性补加，发酵开始后每隔48h补加一次或者在发酵开始后的第2、3、5、8天补加；优选为发酵开始后的第2、3、5、8天补加。
[0015]优选地，在发酵过程中，需要控制发酵体系的pH为6.0-6.9，进一步优选pH6.0-6.4。
[0016]优选地，发酵培养基为棉籽蛋白粉15～25g/L，花生蛋白粉3～5g/L、糊精5～15g/L、甘油60～100g/L、玉米浆干粉5～10g/L、酵母抽提物8～12g/L、L-亮氨酸3～5g/L、哌啶-2-甲酸20～40g/L、KH2PO
4 0.5～1.5g/L、SAG630 1.5～4g/L、MgSO4·
7H2O 0.5～1.5g/L。
[0017]优选地，发酵培养基为棉籽蛋白粉20g/L，花生蛋白粉4g/L、糊精10g/L、甘油80g/L、玉米浆干粉6g/L、酵母抽提物10g/L、L-亮氨酸4g/L、哌啶-2-甲酸30g/L、KH2PO41g/L、SAG6301.9g/L、MgSO4·
7H2O1g/L。
[0018]优选地，发酵过程中，发酵条件为培养温度28～30℃，维持罐压0.05～0.07MPa，通气量1.4～2.0m3/h，转速100～400rpm，溶氧控制在20～30％，培养时间为216～240h。
[0019]优选地，所述的发酵过程是将种子液以8～12％的接种量接入液体发酵培养基中。
[0020]以下内容将详细阐述7-O-去甲基雷帕霉素的发酵方法，包括如下步骤：
[0021](1)菌种活化：将游动放线菌菌种转接种于斜面培养基上，于28～30℃的生化培养箱中培养5～8天，待斜面完全被孢子覆盖，色泽呈红褐色，形态饱满待用；
[0022](2)一级种子液制备：用接种铲从已培养好的西罗莫司产生菌斜面上取一环接种至装有种子培养基的锥形瓶中，摇床转速为200～220r/min，温度为28～30℃，培养44～48h。
[0023](3)二级种子液制备：按照8～12％的接种量将一级种子培养液接种至装有二级种子培养基的锥形瓶中，摇床转速为200～220r/min，温度为28～30℃，培养20～30h。
[0024](4)种子罐培养：按照1～3％接种量将二级种子培养液接种至装有种子培养液的种子罐中，转速80～100rpm，培养16～24h，培养温度28～30℃，通气量0.7～1.4m3/h，罐压0.05～0.1Mpa。
[0025](5)发酵罐培养：将种子罐种子培养液按照8～12％的接种量接入发酵罐中，培养温度28～30℃，维持罐压0.05～0.07Mpa，通气量1.4～2.0m3/h，转速100～400rpm，溶氧控制在20～30％，在发酵过程维持pH6.0～6.4，发酵培养时间为216-240h。在发酵24h后分批次补加补料培养基，直至发酵结束。
[0026]优选地，所述的补料培养基是在发酵开始后的第2、3、5、8天补加，或在发酵24h后每隔48h补加一次。
[0027]优选地，所述的补料培养基为助溶剂及氨基酸。
[0028]进一步优选地，所述的补料培养基为SAG630、L-亮氨酸和/或L-丙氨酸。
[0029]更进一步地，所述的补料培养基为6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7-O-去甲基雷帕霉素的制备方法，其特征在于，以游动放线菌(Actinoplanes)作为发酵菌种，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产7-O-去甲基雷帕霉素，在发酵24h后开始分批次补加补料培养基，至发酵结束。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的补料培养基为助溶剂和氨基酸。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的助溶剂为有机硅型消泡剂、聚醚型消泡剂或聚醚改性有机硅型消泡剂。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸为L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸中的一种或其组合。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的补料培养基为6～15g/L助溶剂与1～3g/L氨基酸。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，马印虎，朱兵峰，刘存磊，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：