一种特异性结合RIPK3的多肽及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合RIPK3的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或其变体所示。还公开了一种包含其的融合蛋白、药物组合物及其应用。本发明专利技术所述的多肽、融合蛋白与RIPK3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断RIPK3蛋白和MLKL蛋白的结合，抑制RIPK3介导的MLKL信号轴。将其应用于制备预防和/或治疗疾病的药物特别是制备预防或治疗呼吸系统疾病例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等的药物中时，能够显著改善肺功能，疗效显著，包括能够显著抑制上皮细胞的坏死性凋亡、显著恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度、降低肺组织的羟脯氨酸含量等优点。量等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合RIPK3的多肽及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种特异性结合RIPK3的多肽及其在制备药物中的应用。

技术介绍

[0002]急性肺损伤是一种威胁生命的呼吸系统疾病，在世界范围内具有高发病率以及高死亡率。急性肺损伤的特征是肺部炎症，包括肺泡上皮细胞以及内皮细胞的损伤、肺水肿以及中性粒细胞的浸润。严重的急性肺损伤会发展成为急性呼吸窘迫综合征。随着急性呼吸窘迫综合征的疾病进展，它会导致许多肺部并发症，最终将导致气体交换困难以及呼吸衰竭。因此，在早期对急性肺损伤病程的缓解对于控制急性呼吸窘迫综合征至关重要。尽管在过去十几年里，有许多关于急性肺损伤的病理生理学研究，但是还是缺少针对急性肺损伤以及急性呼吸窘迫综合征的具体治疗方法，急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的治疗策略必须考虑3个因素：1.潜在疾病的治疗；2.机械通气，确保氧气的畅通以及二氧化碳的消除；3.更改对于治疗特定肺部疾病的辅助程序。
[0003]肺泡上皮细胞损伤与急性肺损伤的发病机制密切相关，当发生损伤时，存在明显的肺泡上皮细胞损伤，损伤后的上皮细胞修复机制会遭到破坏，与此同时肺部会伴随肌成纤维细胞过度活化(即肺纤维化)和细胞外基质沉积。肺泡上皮细胞包括I型肺泡上皮细胞(AEC I)以及II型上皮细胞(AEC II)两种。AEC I覆盖了肺泡95％的表面积，呈扁平状结构，AEC I直接与肺部毛细血管接触，它们构成了机体与外界进行气体交换的气血屏障。AEC II是肺泡微环境中的干细胞，呈方形，具有自己独特的亚细胞结构如板层小体，在正常的生理状况下，AEC II能够合成表面活性物质，通过板层小体与细胞膜的融合释放表面活性物质到肺泡腔中维持表面张力确保肺泡微环境的稳态。肺表面活性物质主要由脂质以及蛋白质组成，其中脂质占比90％。目前治疗急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的药物多为抗生素以及皮质醇类药物，暂无针对肺部细胞生物学功能的药物。临床用治疗肺纤维化的药物包括吡非尼酮和尼达尼布等，但这些药物治疗效果差强人意，仅能延缓轻到中度肺纤维化患者疾病进程。
[0004]当发生急性肺损伤时，肺泡上皮受损，上皮细胞会发生坏死性凋亡，坏死性凋亡的两个关键蛋白，RIPK3(receptor interacting protein kinase 3，受体相互作用蛋白激酶)以及MLKL(Mixed Lineage Kinase Domain
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like Protein)及其磷酸化形式表达上调。AEC I细胞本无增殖能力，肺损伤后的AEC I主要由AEC II增殖分化来补充，而当AEC II发生肺损伤时，不仅肺表面活性物质显著减少，肺泡微环境稳态失衡，同时其向AEC I分化的能力丧失，也促进了急性肺损伤的疾病进展。因此抑制上皮细胞的坏死性凋亡，恢复其原有的功能，可能在急性肺损伤的转归以及药物开发中具有重要意义。
[0005]坏死性凋亡的主要分子机制是：活化的RIPK3能够使MLKL磷酸化，而磷酸化的MLKL会发生寡聚化，随后从胞浆移位到胞膜上结合特定的脂质，进而对胞膜进行打孔，之后钙离子、钠离子会内流，最终会使细胞膜涨裂，引起细胞坏死性凋亡。因此MLKL在坏死性凋亡时
起到了一个“行刑者”的角色。因此急需研究和开发阻断RIPK3磷酸化MLKL的抑制剂等药物，以能够预防或治疗急性肺损伤等呼吸系统疾病。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏能够有效预防或治疗急性肺损伤等呼吸系统疾病的药物的缺陷，提供了一种能够特异性结合RIPK3蛋白的多肽、融合蛋白及其应用。本专利技术所述的多肽、融合蛋白与RIPK3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断RIPK3蛋白和MLKL蛋白的结合，能够与MLKL竞争性地结合RIPK3，抑制RIPK3介导的MLKL信号轴。将本专利技术所述的多肽、融合蛋白应用于制备预防和/或治疗疾病的药物特别是制备预防或治疗呼吸系统疾病例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等的药物中时，能够显著改善肺功能，疗效显著，包括能够显著抑制上皮细胞的坏死性凋亡、显著恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度、降低肺组织的羟脯氨酸含量等优点。
[0007]本专利技术人在研究靶向抑制RIPK3/MLKL信号通路的过程中，发现制备RIPK3/MLKL相互作用的干扰肽存在极大困难。蛋白与蛋白之间相互作用界面的确定需要通过反复的分子生物学实验确认才可知晓，在确定RIPK3/MLKL相互作用结构域后需要进一步通过计算机建模等手段分析这些结构域的蛋白质二级结构，在这些二级结构中本专利技术人经过大量验证、筛选出众多序列后，发现最终筛选出的8条α螺旋序列的效果较佳，本专利技术人进一步通过成功合成这些序列中部分或全部氨基酸后才可以进一步测试多肽与靶点的亲和力后发现，使用本专利技术所述的多肽、融合蛋白与RIPK3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断RIPK3蛋白和MLKL蛋白的结合，能够与MLKL竞争性地结合RIPK3，抑制RIPK3介导的MLKL信号轴，进而将其用于预防和/或治疗例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病时疗效显著。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种特异性结合RIPK3的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或其变体所示；
[0009]所述变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸的任何位置，可适当引入一些氨基酸替换、缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍能形成与RIPK3蛋白特异性结合的多肽且该多肽依然能够保持改变前的活性，从而能够靶向抑制RIPK3/MLKL信号通路即可；优选与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，更优选为至少90％序列同一性，进一步更优选为至少95％、96％、97％、98％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。
[0010]在某一较佳实施例中，所述变体为将如SEQ ID NO:1所示氨基酸中的不为丙氨酸的任一氨基酸单突变为丙氨酸(A)，且所述变体具有特异性结合RIPK3的活性。在某一较佳实施例中，所述变体为将如SEQ ID NO:1所示氨基酸中的任一丙氨酸(A)单突变为甘氨酸(G)，且所述变体具有特异性结合RIPK3的活性。例如所述变体的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11
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29任一所示，例如优选如SEQ ID NO:15、23或26所示。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术第二方面提供了一种融合蛋白，其包括如本专利技术第一方面所述的多肽，和细胞穿膜肽。
[0012]本专利技术所述的细胞穿膜肽为本领域的常规细胞穿膜肽，只要所述的细胞穿膜肽能够辅助将所述多肽送入细胞发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为10
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30个氨基酸组成的短肽分子。所述的多肽衍生物较佳地是将细胞穿膜肽的C端连接MK
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1序列所形成的
嵌合肽。所述的细胞穿膜肽较佳地连接在上述多肽的N端或者C端，更佳地为上述多肽的N端。在某一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合RIPK3的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或其变体所示；所述变体为将如SEQ ID NO:1所示氨基酸中不为丙氨酸的任一氨基酸单突变为丙氨酸、或将如SEQ ID NO:1所示氨基酸中的任一丙氨酸单突变为甘氨酸，且所述变体具有特异性结合RIPK3的活性。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11
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29任一所示。3.一种融合蛋白，其包括如权利要求1或2所述的多肽，和细胞穿膜肽；较佳地：所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的N端或者C端；和/或，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；更佳地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.一种基因，其编码如权利要求1或2所述的多肽，或编码如权利要求3所述的融合蛋白。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含如权利要求4所述的基因。6.一种转化体，其特征在于，其包括如权利要求4所述的基因或者如权利要求5所述的重组表达载体。7.一种多肽、或融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡卓伟，吕晓希，
申请(专利权)人：北京伟峰益民科技有限公司，
类型：发明
国别省市：