一种酸激活穿膜多肽载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酸激活穿膜多肽载体，属于生物医药技术领域。该多肽载体结构通式为：L

【技术实现步骤摘要】
一种酸激活穿膜多肽载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一类具有酸激活穿透细胞膜活性的靶向多肽载体，本专利技术还包括该酸激活穿膜多肽载体在制备药物递送系统、抗肿瘤药物输送以及抗多药耐药方面的应用。

技术介绍

[0002]近年来，穿膜肽CPPs因能作为药物载体携带多种药物和生物分子进入细胞内部并且不会产生明显的毒性而受到广泛关注[Biomaterials.,2013,7080
‑
7993]。但是大多数穿膜肽带正电荷，它们会与带负电荷的细胞膜相互作用，从而缺乏选择性，这阻碍了它们的体内应用[Adv.Drug Deliv.Rev.,2005,529
‑
545；J.Am.Chem.Soc.,2014,12868
‑
12871]。
[0003]为了提高穿膜肽的选择性，降低它们的毒副作用，研究者们提出了很多解决办法，例如用可切割的PEG设计纳米载体来降低传统穿膜肽的非特异性渗透，但是PEG链在肿瘤部位不能被有效全部切断，从而削弱了CPPs的细胞渗透能力[ACS.Nano.,2012,6:3491
‑
8；Mol.Pharm.,2010,7:1816
‑
26]。而肿瘤细胞由于异常增殖使得肿瘤周围环境的pH值略低于正常组织[Mol.Pharm.,2011,8:2032
‑
8]，这为设计酸靶向载体或药物递送系统提供了可能。
[0004]组氨酸作为一种独特的氨基酸，对生物系统具有缓冲能力，组氨酸中咪唑环的pKa值在6.5左右，所以组氨酸在酸性环境中能质子化带正电荷，而在生理pH条件下不带电[Protein.Sci.,2006,15:1214
‑
8]。利用组氨酸这一独特的性质，研究者们设计了一系列pH敏感的富含组氨酸的酸靶向CPPs[Bioconjug.Chem.,2011,22:1410
‑
5]。
[0005]TAT穿膜肽是近年来发现的一类富含碱性氨基酸的短链多肽，具有较强的穿透细胞膜的能力，与核酸分子、药物蛋白分子甚至病毒体表面分子链接后，能将这些物质顺利带入细胞内发挥作用，被称为"生物导弹"。在Tat穿膜肽和低聚精氨酸肽的启发下，研究者们设计了很多阳离子穿膜肽[Chem.Res.,2013,46(12):2944
‑
2954；J.Med.Chem.,2002,45(17):3612
‑
3618；J.Am.Chem.Soc.,2015,137(23):7357
‑
64]。
[0006]上述研究均表明，正电荷的数目对穿膜肽的穿膜活性有重要影响，适量增加肽链所带正电荷能有效提高其的穿膜活性[AIChE.J,2019,65；J.Drug Target.,2011,19(8):675
‑
680]。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一：提供一种结构简单、低毒、可被肿瘤酸性环境激活的穿膜多肽载体。
[0008]本专利技术的目的之二：提供上述酸激活穿膜多肽载体在制备药物递送系统中的应用。
[0009]本专利技术的目的之三：提供上述酸激活穿膜多肽载体在抗肿瘤药物制备中的应用。
[0010]本专利技术的目的之四：提供上述酸激活穿膜多肽载体在抗多药耐药中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012](一)一种酸激活穿膜多肽载体的结构设计
[0013]本专利技术涉及的一种酸激活穿膜多肽载体，其结构中富含亮氨酸、组氨酸及适量正电荷氨基酸，其结构通式为：L
a
H
b
X
n
(不限定三种氨基酸的排列顺序)，其中，
[0014]X＝K或者其它正电荷氨基酸及类似物；
[0015]a＝5、6、7、8、9、10；
[0016]b＝4、5、6、7、8、9；
[0017]n＝0、1、2、3、4。
[0018]具体地，本专利技术所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其结构通式为：Leu
a
His
b
X
n
(不限定三种氨基酸的排列顺序)，其中，
[0019]X＝Lys或者其它正电荷氨基酸及类似物；
[0020]a＝5、6、7、8、9、10；
[0021]b＝4、5、6、7、8、9；
[0022]n＝0、1、2、3、4。
[0023]作为本专利技术技术方案的优选，上述酸激活穿膜多肽载体代表类似物包括L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH
‑
K)，L6H8K2(LH
‑
2K)，L5H9K0(L5H9)和L5H9(K
‑
C6)1(L5H9K
‑
C6)，依次记为：LH，LH
‑
K,LH
‑
2K，L5H9和L5H9K
‑
C6，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示。
[0024]上述酸激活穿膜多肽载体均采用经典固相合成法制备得到。
[0025](二)酸激活穿膜多肽载体穿膜活性研究
[0026]本专利技术以L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH
‑
K)，L6H8K2(LH
‑
2K)，L5H9K0(L5H9)和L5H9(K
‑
C6)1(L5H9K
‑
C6)为例，进行靶向载体肽酸激活穿膜活性研究及其携带抗肿瘤药物发挥抗肿瘤活性的研究。
[0027]1.酸激活肽的细胞摄取实验
[0028]将Hela细胞接种在24孔板中，10万/孔，孵育24h后，吸出孔中原有的培养液。加入pH7.4或pH6.0的含有5μM FITC
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肽的无血清培养基，作用1h后，收集细胞于1.5ml的EP管中，800rpm离心5min，用PBS清洗细胞，再将细胞重悬于500μLPBS中，用细胞流式仪分析肽进入细胞的情况。只用培养基作用的细胞作为空白对照。计算pH6.0条件下平均荧光强度与pH 7.4条件下平均荧光强度的比值。重复三次独立平行实验。结果见图1。
[0029]图1表明，和对照相比，LH，LH
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K,LH
‑
2K，L5H9和L5H9K
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C6在pH6.0条件下的平均荧光强度均明显高于pH7.4条件下，显示出酸激活穿膜活性。
[0030]将hela细胞接种在小皿中，6万/皿。培养24h后，用pH7.4或pH6.0的含5μMFITC
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肽的无血清培养基作用于细胞1h，用PBS清洗细胞一次，每皿中加入1ml PBS，用激光共聚焦显微镜观察肽进入细胞的情况。重复三次独立平行实验。结果如图2所示。
[0031]从图2中可以看出，在pH7.4条件下，LH，LH
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述多肽载体的结构通式为：L
a
H
b
X
n
；其中，X为正电荷氨基酸及类似物，三种氨基酸的排列顺序不限，a＝5、6、7、8、9、10；b＝4、5、6、7、8、9；n＝0、1、2、3、4。2.如权利要求1所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述X为K或其他正电荷氨基酸及类似物。3.如权利要求2所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述酸激活穿膜多肽载体代表类似物包括L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH
‑
K)，L6H8K2(LH
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2K)，L5H9K0(L5H9)和L...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪京满，王锐，常琳琳，张云，
申请(专利权)人：王锐，
类型：发明
国别省市：