合成的DNA载体和使用方法技术

本文提供了包含异源基因的分离的DNA载体，其中所述DNA载体没有可以消除体内持久性的细菌质粒DNA和/或细菌特征。本发明专利技术的特征还在于包括本发明专利技术的DNA载体的药物组合物(非免疫原性药物组合物)，其可用于在受试者中诱导异源基因的长期附加型表达。本发明专利技术涉及通过施用本发明专利技术的DNA载体治疗受试者的方法，包括治疗与靶基因的缺陷相关的障碍的方法。疗与靶基因的缺陷相关的障碍的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成的DNA载体和使用方法
[0001]序列表
[0002]本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过援引以其全文并入的序列表。创建于2020年9月16日的所述ASCII副本被命名为51503
‑
026WO2_Sequence_Listing_9.16.20_ST25，并且大小是18,453字节。


[0003]总体而言，本专利技术特征在于合成的DNA载体。

技术介绍

[0004]基因疗法涉及将异源基因转导到靶细胞中，以纠正受试者中障碍的潜在遗传缺陷。在过去的几十年中，已经开发了多种用于基因疗法的转导方法。例如，传统的细菌质粒DNA载体代表了一种通用的基因递送工具，但由于它们的细菌来源而存在局限性。质粒DNA载体包括细菌基因，例如抗生素抗性基因和复制起点。此外，质粒DNA载体包括细菌特征，例如CpG基序。此外，使用细菌表达系统生产质粒DNA载体涉及引入来自细菌宿主的污染杂质(例如内毒素或细菌基因组DNA和RNA)的风险，这可能例如通过转录沉默导致体内基因表达的丧失。
[0005]重组腺相关病毒(rAAV)载体在各种模型系统中具有高效基因转移的既定记录，现在正在作为多种人类疾病的治疗形式进行测试。rAAV载体的基因组可以作为环状附加体在体内(例如，在有丝分裂后细胞中)持续存在。感染后，单链rAAV DNA在细胞核中转化为双链环状DNA，并在细胞的生命周期内以附加体形式持续存在。因此，AAV载体系统的一个实质性好处是能够在靶细胞中长期存在。另一方面，AAV载体可能涉及另外的缺点，例如约4.5Kb的有限包装容量、病毒蛋白的免疫原性和制造困难。
[0006]因此，该领域需要通用且有效的方法来增强基因表达的长期持久性，例如rAAV提供的方法，同时实现大的有效载荷并降低不利影响(例如炎症)的风险。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了复现rAAV载体的体内持久性的非病毒环状DNA载体。本专利技术的DNA载体是非免疫原性的，并且对AAV包装容量(约4.5Kb)不受限。本专利技术的特征还在于产生环状DNA载体的方法(例如，使用提供比传统的基于细菌的合成提高的制造效率的无细胞方法)、包括环状DNA载体的药物组合物，以及使用本文所述的载体例如用于诱导异源基因的持续附加型表达和用于治疗与缺陷基因相关的疾病的方法。
[0008]在一个方面，本专利技术提供了分离的环状DNA载体，其包括编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，DNA载体缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。治疗性替代蛋白可以是例如酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子。在一些实施例
中，酶是表观遗传调节剂。在一些实施例中，表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶。
[0009]在另一个方面，本专利技术提供了分离的环状DNA载体，其包括编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因。在一些实施例中，DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，DNA载体缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。抗原结合蛋白可以是抗体或其抗原结合片段。抗原结合蛋白可以结合细胞因子、生长因子或细胞表面蛋白(例如，肿瘤相关抗原)。在一些实施例中，抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN
‑
α、IFN
‑
γ、IL
‑
1、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
‑
7、IL
‑
8、IL
‑
9、IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
14、IL
‑
15、IL
‑
16、IL
‑
17、IL
‑
18、IL
‑
21、EMAP
‑
II、GM
‑
CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G
‑
CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD
‑
1、PD
‑
L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK
‑
9、磷脂酰丝氨酸、或骨硬化蛋白。抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和/或抗原结合片段(例如Fab、scFv、scFab等)。
[0010]在另一个方面，本专利技术提供了分离的环状DNA载体，包括编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。生长因子可以是脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G
‑
SCF)、巨噬细胞集落刺激因子(M
‑
CSF)、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、色素上皮源性因子(PEDF)、转化生长因子(TGF；例如，TGF
‑
β)、血管内皮生长因子(VEGF)、促性腺激素、或胰岛素样生长因子。白介素(IL)可以是IL
‑
1(例如IL
‑
1β)、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
‑
7、IL
‑
8、IL
‑
9、IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
14、IL
‑
15、IL
‑
16、IL
‑
17、IL
‑
18或IL
‑
21。干扰素(IFN)可以是IFN
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。2.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。3.如权利要求2所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。4.如权利要求3所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。5.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏免疫原性细菌特征。6.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点。7.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含基本上没有CpG岛的启动子。8.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白分泌到血液中。9.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。10.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。11.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。12.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合的。13.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。14.如权利要求13所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合且超螺旋的。15.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白适用于治疗眼部障碍。16.如权利要求15所述的DNA载体，其中所述眼部障碍是视网膜营养不良。17.如权利要求16所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：斯塔加特病、莱伯氏先天性黑蒙LCA、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB
‑
1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。18.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白适用于治疗凝血障碍。19.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯
·
维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。20.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。21.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。22.如权利要求21所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。23.如权利要求21或22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN
‑
α、IFN
‑
γ、IL
‑
1、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
‑
7、IL
‑
8、IL
‑
9、IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
14、IL
‑
15、IL
‑
16、IL
‑
17、IL
‑
18、IL
‑
21、EMAP
‑
II、GM
‑
CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G
‑
CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、
CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD
‑
1、PD
‑
L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK
‑
9、磷脂酰丝氨酸或骨硬化蛋白。24.如权利要求22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、双特异性抗体或抗原结合片段。25.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。26.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。27.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。28.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述酶是表观遗传调节剂。29.如权利要求28所述的DNA载体，其中所述表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶。30.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述生长因子是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G
‑
SCF、M
‑
CSF、GM
‑
CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。31.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述白介素是IL
‑
1、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
‑
7、IL
‑
8、IL
‑
9、IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
14、IL
‑
15、IL
‑
16、IL
‑
17、IL
‑
18或IL
‑
21。32.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述干扰素是IFN
‑
α或IFN
‑
γ。33.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述凝血因子是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯
·
维勒布兰德因子。34.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述神经保护因子选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl
‑
xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH
‑
A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ
‑
肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。35.如权利要求34所述的DNA载体，其中所述神经营养因子选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT
‑
3、NT
‑
4和CNTF。36.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。37.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是眼部障碍，所述眼部障碍是视网膜营养不良。38.如权利要求37所述的DNA载体，其中所述障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。39.如权利要求38所述的DNA载体，其中所述孟德尔遗传性视网膜营养不良选自由以下
组成的组：莱伯氏先天性黑蒙LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB
‑
1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。40.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是CD40、CD40L、CD46、XCL1、MDA
‑
7、IL
‑
12、IL
‑
24或OPCML(阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子)。41.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是肿瘤抑制基因。42.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码细胞内蛋白质的基因。43.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码分泌的激素或发育信号的受体或信号转导器的基因，所述分泌的激素或发育信号抑制细胞增殖。44.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码检查点控制蛋白的基因。45.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码促凋亡蛋白的基因。46.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码DNA修复蛋白的基因。47.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯
·
维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。48.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。49.如权利要求36或48所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。50.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。51.如权利要求50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。52.如权利要求50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病是中枢神经系统CNS的自身免疫性疾病。53.如权利要求52所述的DNA载体，其中CNS的所述自身免疫性疾病是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。54.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。55.如权利要求54所述的DNA载体，其中所述离子通道病是癫痫或偏头痛。56.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。57.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。58.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述溶酶体贮积障碍选自由以下组成的组：泰
‑
萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼
‑
皮克病和粘多糖贮积症MPS。
59.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。60.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是选自由以下组成的组的退行性心脏病：缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷。61.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述免疫障碍是自身免疫性障碍。62.如权利要求61所述的DNA载体，其中所述自身免疫性障碍是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。63.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述疾病是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。64.如权利要求63所述的DNA载体，其中所述肝病是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。65.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述癌症是血癌或实体组织癌。66.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述血癌是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。67.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述实体组织癌是肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：布鲁斯，
申请(专利权)人：星际治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：