用于多细胞转化的经修饰MRNA制造技术

合成细菌信使RNA可用于制备自体、同种异体或直接核酸癌症疫苗。癌细胞在体外或体内用从编码免疫原性细菌蛋白质的DNA获得的mRNA进行转染。对癌症的免疫反应是通过在体内直接施用该mRNA或在体外施用由癌细胞制备的疫苗产生的。mRNA的密码子修饰可以优化免疫原性多肽在癌细胞中的表达。在癌细胞中的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多细胞转化的经修饰MRNA
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是2020年5月8日提交的美国申请序号16/869,642的接续申请，上述美国申请是2017年5月1日提交、现为美国专利第10,682,401号的美国申请序号15/583,599的部分接续申请，上述美国申请是2016年7月28日提交、现为美国专利第9,636,388号的美国申请序号15/114,943的部分接续申请，上述美国申请是2016年5月19日提交的国际专利申请第PCT/US2016/033235号的美国国家阶段申请，上述国际专利申请要求2015年5月19日提交的美国临时申请序号62/163,446的权益，上述各申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中，包括所有的图、表以及氨基酸和核酸序列。
[0003]本申请的序列表标为“Seq
‑
List.txt”，其创建于2020年4月12日，大小为31KB。序列表的全部内容以全文引用的方式并入本文中。


[0004]本专利技术总体上涉及疫苗，尤其涉及通过癌细胞转染或用合成细菌信使核糖核酸(mRNA)直接瘤内施用制备的癌症疫苗。
[0005]本专利技术更具体地描述了在哺乳动物细胞中有效表达所选多肽的合成RNA以及该RNA在体内或体外转化细胞的用途。
[0006]本专利技术提供了用于癌症治疗的有效mRNA疫苗的开发和用途。虽然脱氧核糖核酸(DNA)疫苗有若干缺陷(包括转染效率低和递送方法耗时)，但本专利技术的mRNA疫苗被直接施用到肿瘤细胞中并被立即翻译成引起多肿瘤抗原反应的免疫原性蛋白质。与质粒DNA相比，mRNA的体内半衰期较短，这使得其不太可能整合到宿主基因组中，因此被认为更安全。与DNA不同，mRNA疫苗不需要穿过核膜，因此通常可以产生更快和更高水平的蛋白质表达。此外，转染mRNA的表达与细胞周期无关，并且由于mRNA的水平不受启动子驱动，因此可以通过改变转染的mRNA水平来调节蛋白质表达和疫苗剂量。与肽对比，mRNA疫苗缺乏主要组织相容性复合体(MHC)单倍型限制，可以设计成通过添加MHC I运输信号或与鱼精蛋白组合进行自我调节。尽管mRNA疫苗的功效可能受益于保护RNA免于降解并增强细胞摄取的复合剂，但在没有其它试剂或物理转导方法的情况下，体内细胞可以用mRNA转染。用作疫苗的信使RNA可以使用体外转录从质粒DNA中产生。

技术介绍

[0007]癌症的治疗基于诊断出的特定类型。一些常见的癌症包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤和前列腺癌。治疗方案由医生根据多种因素的评估制定，包括但不限于疾病阶段、病因和患者年龄和总体健康状况。对于许多癌症，治疗方案可以包括手术、化学疗法、放射疗法、骨髓/干细胞移植、抗癌药物或免疫疗法中的一种或组合。最常见的治疗方法包括手术、化疗、放疗和口服药物。尽管这些治疗可能有效，但通常有许多副作用。化疗尤其针对体内所有新分裂的细胞，而不仅仅是癌细胞。
[0008]一些免疫疗法的优点是能够靶向患病细胞，同时使未患病细胞保持完整。癌细胞
源于正常生长调节机制的崩坏；因此，身体仍然将癌细胞中的许多视为自体的。癌症免疫疗法克服了身体对这些患病自体细胞的耐受性，并使身体能够将它们区分为外来的。癌症还可以通过降低细胞上免疫激活标记(如MHC分子)的表达直接抑制人体免疫系统来逃避免疫检测。MHC是对于身体区分哪些细胞是自体细胞以及哪些细胞是外来或患病的细胞有帮助的成分之一。
[0009]实体癌的治疗通常包括化疗和/或手术。最近，人们对开发疫苗以刺激自体免疫防御产生了兴趣。美国专利第7,795,020号详细描述了一种淋巴瘤疫苗，用于治疗晚期淋巴瘤，其转化自体或非自体细胞分离自诊断患有淋巴瘤的受试者。分离的细胞用携带化脓性链球菌emm55基因的质粒载体转染。细菌蛋白在细胞表面表达，当将转染的细胞引入患有癌症的受试者时，会产生对淋巴瘤细胞的免疫反应。
[0010]迄今为止，FDA仅批准了细胞癌症免疫疗法疫苗Provenge用于治疗前列腺癌；然而，一些疫苗目前正在临床试验中进行测试。BiovaxId是一种自体肿瘤衍生的免疫球蛋白独特型疫苗，正在进行III期临床研究，用于治疗惰性滤泡非霍奇金淋巴瘤。
[0011]原则上，外源DNA或RNA都可以在哺乳动物体内表达蛋白质。DNA和mRNA表达的蛋白质是否可以产生类似的免疫活性尚不确定。传统观点认为DNA因其稳定性和易用性而更适合用于疫苗生产和基因治疗。质粒DNA疫苗的一个实例是Merial的Oncept，它是为治疗口腔犬黑色素瘤而开发的。
[0012]已经报道了关于mRNA疫苗的工作。在一个案例中，使用脂质体递送了一种有效的mRNA疫苗。在将编码流感病毒蛋白的mRNA施用至小鼠体内后，这种特殊的疫苗在体内诱导细胞毒性T淋巴细胞。CureVac GMH的其它研究表明，mRNA疫苗在皮内递送时会引发体液和细胞免疫反应。这种疫苗以裸露的形式施用，并与鱼精蛋白复合，鱼精蛋白是一种增强mRNA稳定性和改善蛋白质表达的蛋白质。此疫苗目前正在进行去势抵抗性前列腺癌的临床试验。
[0013]已经使用mRNA对液体和实体肿瘤进行了人体试验。癌症包括急性髓性淋巴瘤、转移性黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌/卵巢癌、神经母细胞瘤、脑癌、肺癌、结肠癌和肾细胞癌。目前正在进行的大多数临床试验都涉及将mRNA转染到自体树突细胞中，而不是癌细胞中。此外，还没有尝试使用mRNA的瘤内施用的临床试验。图3是已发表的使用mRNA疫苗的临床试验表。
[0014]如脂质体和阳离子聚合物等递送载体似乎有望增强转染。一旦脂质体或聚合物复合物进入细胞质，mRNA必须能够与递送载体分离，以实现抗原翻译；不幸的是，这些载体可能无法与mRNA正确复合，且因此无法正确翻译所编码的蛋白质。可能会产生抗原，但其量不足以产生所需的效果。
[0015]许多免疫疗法是疾病特异性的，概念复杂，并且生产起来更加复杂和昂贵。此类疗法是否具有商业可行性还有待观察。将mRNA直接施用到患者的肿瘤中具有深远的意义，mRNA在该肿瘤中立即被翻译成一种免疫原性蛋白，从而引发多肿瘤抗原反应。例如，单个合成mRNA可用于治疗多个物种的多种类型的癌症。mRNA易于递送、具有成本效益、易于运输和储存以及易于施用。连同出色的安全性，mRNA的这些属性使得治疗全球癌症患者成为可能，甚至在发展中国家也是如此。
[0016]引导免疫系统杀死癌细胞是所有癌症免疫疗法的基础。为了使任何类型的免疫疗
法成功，必须触发对肿瘤相关抗原的免疫反应并允许其放大。免疫反应可以涉及任何数量的免疫细胞，包括抗原呈递细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、T辅助细胞、T细胞毒性细胞和B细胞等。然而，在人类癌症疫苗试验中，对单个肿瘤抗原的免疫反应的触发和激活还不足以转化为有益的临床疗效，很可能是由于免疫逃逸变异；也没有使用完整的肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物加上外源佐剂作为多种相关肿瘤抗原的供应者。这就是为什么必须能够在肿瘤抗原的背景下提供触发物，因为它们在患者的肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在人细胞中表达的密码子优化的核糖核酸，其在用所述核糖核酸转化的细胞中表达由SEQ ID NO:14编码的聚核苷酸。2.根据权利要求1所述的密码子优化的核糖核酸，其选自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19组成的组。3.根据权利要求1所述的密码子优化的核糖核酸，其中所述转化细胞是癌细胞。4.根据权利要求3所述的密码子优化的核糖核酸，其中所述转化癌细胞在引入至癌症患者体内时诱导免疫原性反应。5.根据权利要求3所述的密码子优化的核糖核酸，其中所述癌细胞选自癌瘤、肉瘤、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或两种或更多种所述细胞的混合物。6.根据权利要求1所述的密码子优化的核糖核酸，其在体内引入至肿瘤或肿瘤引流淋巴结时表达免疫原性聚核苷酸。7.根据权利要求6所述的密码子优化的核糖核酸，其中所述肿瘤或肿瘤引流淋巴结包含癌瘤、肉瘤、骨髓瘤或淋巴瘤细胞。8.一种合成核糖核酸，其包含近端设计元件，所述元件增加具有SEQ ID NO:14的序列的多肽在用所述核糖核酸转化的哺...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：摩尔福基因有限公司，
类型：发明
国别省市：