一种人脐血造血干细胞体外扩增和维持干性用培养基制造技术

本发明专利技术属细胞培养技术领域，提供一种人脐血造血干细胞HSCs体外扩增和维持干性用培养基。按含有添加剂的无血清银耳多糖培养基为计算基准，银耳多糖浓度为0.1%g/ml，体积比各0.9%的HEPES、PSG、ITS

【技术实现步骤摘要】
一种人脐血造血干细胞体外扩增和维持干性用培养基


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种人脐血造血干细胞HSCs体外扩增和维持干性用培养基。

技术介绍

[0002]造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）是造血系统中具有自我更新且能分化成所有成熟血液谱系能力的一群细胞，对于维持机体的造血内稳态及免疫功能尤为重要。目前，HSCs移植（HSCT）已经被认为是治疗部分造血系统恶性肿瘤、造血障碍及免疫缺陷的有效疗法，根据干细胞的来源，将HSCT分为骨髓移植(BMT)、脐带血造血干细胞移植(CBT)和外周血造血干细胞移植(PBSCT)。与骨髓、动员后外周血相比，脐血具有易获得、对供体无害、供受体人类白细胞抗原（HLA）相合要求不高等优势。此外，脐血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）还凭借移植后恶性原发疾病的复发率较低，慢性移植物抗宿主病（chronic graft
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versus
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host disease，cGVHD）发生率低、程度轻，移植后患者生活质量高等优势，30年来其临床应用取得了显著成效，但也仍存在一些亟待深入研究的问题。单份脐血中所包含的细胞数量如总有核细胞数、CD34+细胞数等相对较少，植入速率仍比同胞HLA相合的HSCT延缓，不足以满足病人的造血重建需求。临床经验表明，干细胞剂量（测量为CD34+细胞数）与患者存活率和植入所需时间相关，表明造血干细胞和祖细胞（HSPC）的扩增有望对其临床应用产生极大的益处。
[0003]有效的HSCs体外扩增除总有核细胞数、CD34+细胞数等数量上显著增多外，更重要的是这些细胞移植到受体后能够长期稳定地重建髓系和淋系造血。根据扩增后移植到一级和二级受体后的重建动力学可将HSCs亚型分为长期和短期造血干细胞(long term hematopoietic stem cells，LT
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HSCs和short term hematopoietic stem cells，ST
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HSCs)，LT
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HSCs位于造血系统的顶端，分为静止和循环两种状态。LT
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HSCs产生ST
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HSCs，随后产生多能祖细胞（multipotent progenitor，MPPs）、谱系特异性祖细胞和终末分化造血细胞。LT
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HSCs移植后受体无论在髓系还是淋系细胞均显示出高供体嵌合体，在移植后4周达到阈值，并在一级受体和二级受体移植后24周保持该阈值。而ST
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HSCs在移植后24周内没有为任何一个谱系提供持续的嵌合体水平。因此，扩增后细胞群中LT
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HSCs的比例和绝对数量对受体能否长期稳定地重建多系造血至关重要，那么探寻一种有效的HSCs体外扩增，促进其自我更新，保持其多潜能性，减少其分化的最佳生长条件成为解决问题的关键。
[0004]1978年Schofield首次提出骨髓造血微环境“Niche”的概念，他发现Niche参与HSCs的维持、自我更新和多向分化的调控。之后，通过对体内骨髓微环境的描述和基因修饰小鼠模型的构建，人们已经对HSCs的维持因子进行了大量的研究，并证实来自微环境的信号是HSCs自我更新调节及分化的关键贡献者。多种基质细胞成分及由其产生的细胞因子共同构成骨髓的造血微环境,与造血细胞相互作用维持机体的正常造血功能。
[0005]文献报道，微环境内促进HSCs体内自我更新的细胞类型和因子主要包括：间充质干细胞（MSCs）、骨内成骨细胞、瘦素受体阳性（Lepr+）血管周围基质细胞、富含CXCL12的网
状（CAR）细胞、骨桥蛋白（OPN）、血小板生成素（THPO）、粒细胞集落刺激因子（G
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CSF）、干细胞因子（SCF）和CXC趋化因子配体12（CXCL12或SDF
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1）等。因此，在现有的人HSCs体外扩增培养体系中，研究者们常常将HSCs与MSCs或内皮细胞共培养，或者向培养基中添加上述的一种或几种细胞因子（如SCF、TPO、FLT
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3L、IL
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3、IL
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6等）以模拟骨髓微环境，促进HSCs的维持和扩增。除上述可溶性因子外，骨髓微环境还提供了特定的3D结构，与2D培养相比，3D培养系统（如非织造多孔载体、大孔胶原载体和多孔微球）可导致人类HSCs自我更新增加数倍，且通过补充细胞因子进一步增强扩增效果。其中纤维连接蛋白固定的3D支架使人HSCs显著扩增达100倍。
[0006]基于对体内骨髓HSCs微环境的描述，人们已经对HSCs的维持因子进行了大量的研究，目前常见的造血干细胞体外扩增的条件包括：分选合适的起始细胞群（如：CD34+、CD34+CD38
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或者CD34+CD38
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CD90+CD49f+），运用无血清培养基（需添加白蛋白替代物）培养，添加细胞因子（一般包括Scf、Tpo、Flt3L、IL
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3、IL
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6等），辅以一些小分子化合物（如UM171、SR1、丙戊酸钠），模拟骨髓三维空间结构（3D
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PDMS）等。
[0007]从细胞因子研究中获得的结果表明，尽管几种细胞因子（尤其是Scf和Tpo）可以有效刺激体外细胞存活和增殖，国内外已有的方案可在7天内将CD34+ HSPCs扩增17
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156倍，持续扩增21
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35天甚至可达1118
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17100倍，但这些细胞因子本身通常不足以支持自我更新，它们通常诱导HSCs分化，最多只能维持或适度扩增干细胞，导致长期再增殖细胞的逐渐耗竭,移植后重建能力降低。综上所述，通过基于细胞因子的体外扩增方案提高HSPCs植入率的努力基本上没有成功,这表明需要额外的因子/分子来支持HSC在体外的自我更新和扩增。
[0008]研究证实，血清白蛋白（human serum albumin，HSA）在HSCs培养中可能具有多种功能，其主要作用为“载体分子”，然而由于血清白蛋白一直被认为是HSCs培养物中生物污染的主要来源，因此探寻一种有效的血清白蛋白替代物成为必然。Adam C. Wilkinson等人发现聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一种功能优越且经济实惠的血清白蛋白替代品，可使小鼠功能性HSCs在1个月内扩张236
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899倍，且50个细胞来源的HSCs培养物可在受体小鼠体内牢固植入。该系统也可支持人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞体外扩增培养。然而与小鼠不同的是，人LT
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HSCs的扩增对两亲性分子PVA并不敏感。推测可能存在更优的白蛋白代替物，作为人LT
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HSCs体外扩增的载体。
[0009]理想的“载体分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐血造血干细胞HSCs体外扩增和维持干性用培养基，其特征在于：包括含有添加剂的无血清银耳多糖培养基，按照含有添加剂的无血清银耳多糖培养基为计算基准，银耳多糖的浓度为0.1% g/ml，添加体积比为各0.9%的HEPES、PSG和ITS
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X；按照最终制备的人脐血造血干细胞HSCs体外扩增和维持干性用培养基为计算基准，在含有添加剂的无血清银耳多糖培养基中加入终浓度依次为：SCF 20 ng/mL、TPO 80ng/mL、TEPA 5μM、VPA 50μg/ml、dmPGE2 0.5mM、UM171 35nM 和SR1 1μM。2.制备权利要求1所述的一种人脐血造血干细胞HSCs体外扩增和维持干性用培养基的方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）0.5g银耳多糖粉末溶于50ml无菌生理盐水，剧烈震荡，配置为0.01g/ml备用；（2）436.5mlIMDM培养基添加HEPES、PSG、ITS
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【专利技术属性】
技术研发人员：任颜，王宏伟，殷勤伟，覃艳红，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：