MAPK信号通路抑制剂VX-702在提高hESCs造血分化潜能的应用制造技术

本发明专利技术为MAPK信号通路抑制剂VX

【技术实现步骤摘要】
MAPK信号通路抑制剂VX
‑
702在提高hESCs造血分化潜能的应用


[0001]本专利技术为MAPK信号通路抑制剂VX
‑
702在提高hESCs造血分化潜能的应用，属于生物
领域，尤其是多能干细胞培养过程研究中，一种利用小分子抑制剂促进人类胚胎干细胞(hESC)造血分化潜能，提高造血祖细胞产生效率的应用方法。

技术介绍

[0002]现有的体外造血分化体系提高造血分化效率的有效方法主要是体外改变某些造血分化关键基因的表达或改变造血微环境。可诱导过表达的基因修饰方法可以改变细胞转录谱来促进造血祖细胞产生，这样处理的优点是：可以在特定时间和特定空间调控基因表达，但是也存在着一些显著的缺点，比如构建转基因细胞系耗时耗功，基因随机插入细胞基因组中可能有癌变的潜在危险，不同批次和克隆所建立的转基因细胞系基因表达量的调控也有所不同。这些都是不可控因素，影响体系的稳定性。
[0003]目前我们实验室已经建立了一套人胚胎干细胞向造血干/祖细胞及成熟血细胞定向分化模型的方法，包括：人类多能干细胞系维持未分化培养及其与AGM
‑
S3共培养产生造血干/祖细胞，随后通过液体悬浮培养定向诱导分化为成熟血细胞，包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、红细胞及巨噬细胞等等。时至今日，该方法已经广泛用于研究多能干细胞向造血分化转变过程中涉及的细胞学/分子机制。本实验室通过筛选和调控人类多能干细胞培养过程中关键基因的表达和关键信号通路状态，观察该基因或信号通路在人类多能干细胞向造血分化过程中可能发挥的效应和功能。
[0004]我们的造血分化研究是以人类多能干细胞(hPSC)为起始细胞来源，该类细胞系都具有强烈沉默载体表达外源基因的特性，是构建转基因细胞系较为困难的细胞种类；而从hPSC向造血分化过程中，会出现很多种细胞型，需要在各个不同的细胞型和发育时期实现基因的诱导过表达，对载体系统都提出了极为苛刻的要求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的专利技术目的是针对现有技术存在的问题，提供一种MAPK信号通路抑制剂VX
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702在提高hESCs造血分化潜能的应用方法。这是一种相对转基因方法而言更加操作简单、快速、经济的方法来达到促进造血祖细胞产生的目的，是一种运用小分子抑制剂提高hPSC造血分化潜能的新方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的具体技术方案为：
[0007]一种MAPK信号通路抑制剂VX
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702在提高hESCs造血分化潜能的应用。
[0008]该MAPK信号通路抑制剂VX
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702能促进hESCs在体外造血分化体系内造血分化效率。
[0009]一种高效便捷促进造血祖细胞产生的方法，其包括以下步骤：
[0010]在人类多能干细胞培维持培养阶段，向培养皿中加入MAPK信号通路抑制剂VX
‑
702，在维持培养阶段持续处理，将持续处理后的hESC细胞进行体外造血分化，相比未处理细胞，其血液祖细胞的产量显著提高，并最终导致末端分化血细胞产量的相应提升。
[0011]作为优选的典型代表，所述的祖细胞为造血祖细胞、髓系祖细胞、红系祖细胞。
[0012]作为本申请中一种较好的实施方式，培养皿中加入的MAPK信号通路抑制剂VX
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702的终浓度为1
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7.5nM，更优选为5nM。
[0013]作为本申请中一种较好的实施方式，在维持培养阶段持续处理的时间为5天。
[0014]进一步的，所述的MAPK信号通路抑制剂VX
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702的化学式为：
[0015][0016]作为本申请中一种较好的实施方式，所述MAPK信号通路抑制剂VX
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702的配制步骤为：将VX
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702粉末溶于DMSO，储存浓度为5μM，分装冻存于
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80℃，备用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的积极效果体现在：
[0018](一)、该小分子抑制剂容易获取，配制简便。从公司购买小分子抑制剂粉末溶于DMSO配制成所需浓度即可。
[0019](二)、操作简单，直接加入试剂到培养基中即可，不需要进行转染细胞和建立细胞系等操作，基本不影响细胞状态或产生癌变。
[0020](三)、小分子抑制剂工作浓度不高，对细胞没有明显毒性，成本也较低。
[0021](四)、能够全面提高hESC的造血分化潜能，对于各个造血谱系的都有促进作用，原则上适用于不同体外造血分化体系提高造血分化体系。
附图说明：
[0022]图1为实施例中流式细胞检测结果图；
[0023]图2为实施例中集落培养结果图；
[0024]图3为实施例中细胞分选实验结果图；
具体实施方式
[0025]为了使申请的专利技术目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0026]以下实施例中试剂盒试剂等相关材料均为市售商品；MAPK信号通路抑制剂VX
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702的化学式为：
[0027][0028]一.材料
[0029]1.主要仪器和试剂：
[0030](1)主要仪器及耗材
[0031]超净工作台LABCONCOA2
[0032]CO2培养箱ThermoHERACSLSD
[0033]普通倒置显微镜OLYMPUSCKX31
[0034]流式细胞仪BDFACSCantoII/Calibur
[0035]台式常温高速离心机ThermoLABOFUGE400
[0036]生物辐照仪RADSOURERS
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2000
[0037]贴壁12孔板CORNING
[0038](2)主要试剂
[0039]BSA美国SigmaA9418
[0040]IMDM培养基美国GIBCO12440053
[0041]DMEM培养基美国SigmaD5796
[0042]F12培养液美国GIBCO21700
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075
[0043]KSR血清美国GibcoN10828
‑
028
[0044]mTeSR1培养基美国STEMCELL05850
[0045]Y
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27632(ROCK抑制剂)德国MERCK688000
[0046]改良型α
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MEM美国HycloneSH30265.01B
[0047]非必需氨基酸(NEAA)美国Gibco07796
[0048]β
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巯基乙醇美国Sigma
[0049]0.25％Trypsin/EDTA(WT/V)美国Gibco25200056
[0050]胎牛血清(FBS)美本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MAPK信号通路抑制剂VX
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702在提高hESCs造血分化潜能的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：该MAPK信号通路抑制剂VX
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702能促进hESCs在体外造血分化体系内造血分化效率。3.一种高效便捷促进造血祖细胞产生的方法，其特征在于包括以下步骤：在人类多能干细胞培维持培养阶段，向培养皿中加入MAPK信号通路抑制剂VX
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702，在维持培养阶段持续处理，将持续处理后的细胞进行体外造血分化；相比未处理细胞，其血液祖细胞的产量显著提高，并最终导致末端分化血细胞产量的相应提升。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的血液祖细胞为造血祖细胞、髓系祖细胞、红系祖细胞。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：培养皿中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈波，易丹英，孙文翠，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：