一种酵母三杂交筛选与pBridge-X-Y相互作用蛋白的实验方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，并提供一种酵母三杂交筛选与pBridge

【技术实现步骤摘要】
一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法。

技术介绍

[0002]生物技术是应用生物学、化学和工程学的基本原理，利用生物体(包括微生物，动物细胞和植物细胞)或其组成部分(细胞器和酶)来生产有用物质，或为人类提供某种服务的技术，近些年来，随着现代生物技术突飞猛进地发展，包括基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程以及生化工程所取得的成果，利用生物转化特点生产化工产品，特别是用一般化工手段难以得到的新产品，改变现有工艺，解决长期被困扰的能源危机和环境污染两大棘手问题，愈来愈受到人们的关注，且有的已付诸现实，生物技术中通过筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的
尚未达成较高的成就与发展，致使生物发展进程缓慢，为此现提出一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法。

技术实现思路

[0003]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法，由以下具体技术手段所达成：
[0004]本专利技术为实现技术目的采用如下技术方案：一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑<br/>Y相互作用蛋白的实验方法，包含有材料的准备，所述材料的准备包含有诱惑克隆、诱惑载体、文库酵母质粒、Clontech酵母三杂交系统、培养基；具体实验筛选步骤如下：
[0005]S100、将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测；
[0006]S101、文库筛选；
[0007]S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；
[0008]S103、测序比对结果；
[0009]S104、酵母阳性克隆回转验证；
[0010]S105、回转验证结果。
[0011]优选的，所述诱饵克隆为pBridge
‑
X
‑
Y，所述诱饵载体为pBridge，所述文库酵母质粒为pGADT7
‑
某物种cDNA；所述培养基为酵母完全培养基与酵母缺陷型筛选培养基。
[0012]优选的，所述将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测包含有酵母转化、酵母转化方法于自激活验证，所述酵母转化是将表1的质粒分别转入Y2H Gold酵母中。
[0013]1.根据权利要求3所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述酵母转化方法包含以下步骤：
[0014]S200、从YPDA平板挑取Y2H Gold单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18
‑
20h(过夜)，至OD600&gt;1.5；
[0015]S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，
振荡培养4
‑
5h，至OD600＝0.6
‑
0.8；
[0016]S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min，用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0017]S203、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；
[0018]S204、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；
[0019]S205、每个1.5ml离心管中依次加入表格2的试剂中，用枪头吹打混匀，剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
[0020]S206、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；
[0021]S207、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0022]S208、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板；
[0023]S209、30℃恒温培养4天。
[0024]优选的，所述自激活验证是随机挑取8个点用pBridge的载体引物进行PCR验证，全部为正确克隆，随机抽取了三个克隆点板至SD
‑
T、SD
‑
TH、SD
‑
THA、SD
‑
THA+X
‑
α
‑
gal板上，30℃培养3
‑
5d。其中pBridge
‑
Y为阴性对照。
[0025]根据权利要求1所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
‑
Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述文库筛选是用含有pBridge
‑
X
‑
Y诱饵质粒的Y2H Gold酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7
‑
某物种cDNA转入其中，涂SD
‑
TLH，SD
‑
TLH+10mM 3AT，SD
‑
TLHM，SD
‑
TLHM+10mM 3AT筛选平板；所述文库筛选包含有文库DNA转化方法与文库筛库结果。
[0026]优选的，所述文库DNA转化方法具体步骤如下：
[0027]S300、从SD
‑
T平板挑取单菌种接于液体SD
‑
T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；
[0028]S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
‑
5h，至OD600＝0.6；
[0029]S302、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
‑
5h，至OD600＝0.6；
[0030]S303、离心收菌，室温，4000rpm，5min，用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用10ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0031]S304、向离心管中依次加入表3中试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母三杂交筛选与pBridge
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X
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Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：包含有材料的准备，所述材料的准备包含有诱惑克隆、诱惑载体、文库酵母质粒、Clontech酵母三杂交系统、培养基；具体实验筛选步骤如下：S100、将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测；S101、文库筛选；S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；S103、测序比对结果；S104、酵母阳性克隆回转验证；S105、回转验证结果。2.根据权利要求1所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
‑
X
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Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述诱饵克隆为pBridge
‑
X
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Y，所述诱饵载体为pBridge，所述文库酵母质粒为pGADT7
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某物种cDNA；所述培养基为酵母完全培养基与酵母缺陷型筛选培养基。3.根据权利要求1所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
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X
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Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测包含有酵母转化、酵母转化方法与自激活验证，所述酵母转化是将表1的质粒分别转入Y2H Gold酵母中。4.根据权利要求3所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
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X
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Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述酵母转化方法包含以下步骤：S200、从YPDA平板挑取Y2H Gold单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18
‑
20h(过夜)，至OD600&gt;1.5；S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
‑
5h，至OD600＝0.6
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0.8；S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min，用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；S203、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；S204、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；S205、每个1.5ml离心管中依次加入表格2的试剂中，用枪头吹打混匀，剧烈振荡1min左右，至完全混匀；S206、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；S207、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；S208、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板；S209、30℃恒温培养4天。5.根据权利要求1所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
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X
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Y相互作用蛋白的实验方法，其特征在于：所述自激活验证是随机挑取8个点用pBridge的载体引物进行PCR验证，全部为正确克隆，随机抽取了三个克隆点板至SD
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T、SD
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TH、SD
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THA、SD
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THA+X
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α
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gal板上，30℃培养3
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5d。其中pBridge
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Y为阴性对照。6.根据权利要求1所述的一种酵母三杂交筛选与pBridge
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X
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Y相互作用蛋白的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：