一种构建纳米抗体文库的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：单条抗体序列为模板，按照配方比例配置PCR扩增体系，上述产物CDR区进行NNK随机突变，进行电转感受态，获得全合成纳米抗体文库，处理后的产物进行文库质量鉴定，并对得出的信息进行数据分析并记录；通过全合成纳米文库，增加了抗体文库的库容量，多样性，增强了文库的可控性，可用于高亲和力抗体地筛选；同时也解决了天然纳米文库受限制的弊端，可以大批量地构建与生产，减少成本，节约时间。节约时间。节约时间。

【技术实现步骤摘要】
一种构建纳米抗体文库的方法


[0001]本专利技术属于纳米文库
，具体涉及一种构建纳米抗体文库的方法。

技术介绍

[0002]骆驼科动物体内存在一种只含重链不含轻链的天然重链抗体(hcAb)，克隆骆驼体内重链抗体的可变区后得到的仅由重链可变区组成的单域抗体，称为纳米抗体(VHH)。
[0003]现已有的天然纳米抗体文库受限于骆驼科材料本身的限制，未经抗原免疫的、筛选获得的纳米文库亲和力较低，很难得到库容量大的纳米文库且多样性好的纳米文库，为此我们提出一种构建纳米抗体文库的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种构建纳米抗体文库的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]A.单条抗体序列为模板，按照配方比例配置PCR扩增体系；
[0007]B.上述产物CDR区进行NNK随机突变，进行电转感受态，获得全合成纳米抗体文库；
[0008]C.处理后的产物进行文库质量鉴定；
[0009]D.并对得出的信息进行数据分析并记录。
[0010]进一步地，步骤A中具体为对所得的PCR产物通过移液器配合纯化试剂盒进行PCR产物纯化，具体步骤如下：
[0011]a)按照1:1的体积比，向PCR产物中加入Binding Buffer，混合均匀；
[0012]b)向上述混合液中按照1:2的体积比加入异丙醇溶液；
[0013]c)将吸附柱置于收集管中并转移溶液至吸附柱上，静置1min，10,000r/min离心30s，弃流出液；
[0014]d)在吸附柱中加入700μL的洗涤液，12,000r/min离心30s，倒掉流出液；
[0015]e)12,000r/min离心1min以除去残留液体，之后开口放置5min以除去吸附柱的乙醇；
[0016]f)将吸附柱放入到一个干净的1.5mL离心管中，加入50μL经过65℃预热的Elution Buffer，静置1min，12,000r/min离心1min；
[0017]g)离心管底部收集的液体即为纯化后的PCR产物，置于
‑
20℃保存；
[0018]h)重复上述步骤依次再进行第二次、第三次纯化。
[0019]进一步地，对所得PCR产物切胶回收，切胶回收通过移液器配合纯化试剂盒，具体方法如下：
[0020]a)将切下来的目的片段放入一个干净的1.5mL离心管中，并称量胶的重量；
[0021]b)按照1:1的体积比向离心管中加入Binding Buffer；
[0022]c)60℃水浴10min，在此过程中适当混匀离心管，使胶充分溶解；
[0023]d)把上述溶液转移至吸附柱中，室温静置1min，12,000rpm离心1min，弃流出液；
[0024]e)在离心柱中加700μL的洗涤液，12,000rpm离心1min，弃流出液；
[0025]f)12,000rpm离心1min，彻底除去残留的洗涤液，之后开口放置5min以除去吸附柱中的乙醇；
[0026]g)将吸附柱置于一个干净的1.5mL离心管中，在柱的中央加入50μLEB溶液(60
‑
70℃水浴预热)，室温静置1min；
[0027]h)12,000rpm离心1min，洗脱DNA，将洗脱得到的DNA置于4℃备用。
[0028]进一步地，电转感受态具体为：
[0029]1)将纯化得到的连接体系加入TOP10感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀；
[0030]2)将加有连接体系的感受态细胞分装于电击杯中(
‑
20℃预冷)，每个电击杯分装100μL，冰上静置5min；
[0031]3)将电击杯放入电转化仪中电转，电转参数设置为2.5kV，25μF，200Ω，电转完成后立即加入900μL的SOC培养基混匀；
[0032]4)将电转杯中的培养基吸到500mL的锥形瓶中，每个电击杯中加入1mLSOC培养基冲刷电转杯，之后将培养基吸到锥形瓶中，180r/min复苏1h；
[0033]5)4,000r/min将上述培养基离心10min，倒掉上清，收集菌体，用25mL的2
×
TY培养基重悬菌体；
[0034]6)将菌液涂于180mm的2
×
TY/A平板上，正放至菌液吸收后，将平板倒置于培养箱中30℃过夜培养。
[0035]进一步地，所述文库质量鉴定具体为：
[0036]1)纳米抗体文库库容的鉴定吸出100μL所构建的全合成纳米抗体文库，按照10
‑
1，10
‑
2到10
‑
7梯度稀释，将各个梯度的菌液各吸出100μL涂于90mm的2
×
TY/A平板上，于37℃培养箱中过夜培养；对各稀释度平板上的单菌落计数，选择单菌落个数合适的平板，根据稀释度计算文库的库容；
[0037]2)VHH片段插入率的检测挑取平板上的若干个单克隆分别溶于10μL去离子水中，吸出3μL菌液作为菌落PCR的模板，将剩余菌液转接于含有5mL LB/A液体培养基的试管中，过夜培养，上游引物和下游引物分别使用F1和R3；
[0038]3)VHH片段插入正确率和多样性的检测随机挑取平板上的100个单克隆送至测序公司测序验证，使用通用引物5
’‑
CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC
‑3’
测序。
[0039]进一步地，溶于10μL去离子水中单克隆的数量为30个。
[0040]进一步地，将100μL异丙醇溶液加入到含有100μLPCR产物和100μL Binding Buffer混合液中。
[0041]进一步地，过夜培养后参照菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果，根据电泳位置确定插入VHH片段的个数，计算文库的插入率。
[0042]相比于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0043]通过全合成纳米文库，增加了抗体文库的库容量，多样性，增强了文库的可控性，可用于高亲和力抗体的筛选；同时也解决了天然纳米文库受限制的弊端，可以大批量的构建与生产，减少成本，节约时间。
附图说明
[0044]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
[0045]图1为本专利技术的模式图；
[0046]图2为本专利技术第一轮PCR反应体系(50μL)的示图；
[0047]图3为本专利技术第一轮PCR反应条件的示图；
[0048]图4为本专利技术第二轮PCR反应体系(50μL)的示图；
[0049]图5为本专利技术第二轮PCR反应条件的示图；
[0050]图6为本专利技术第三轮PCR反应体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：A.单条抗体序列为模板，按照配方比例配置PCR扩增体系；B.上述产物CDR区进行NNK随机突变，进行电转感受态，获得全合成纳米抗体文库；C.处理后的产物进行文库质量鉴定；D.并对得出的信息进行数据分析并记录。2.根据权利要求1所述的一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于：步骤A中具体为对所得的PCR产物通过移液器配合纯化试剂盒进行PCR产物纯化，具体步骤如下：a)按照1:1的体积比，向PCR产物中加入Binding Buffer，混合均匀；b)向上述混合液中按照1:2的体积比加入异丙醇溶液；c)将吸附柱置于收集管中并转移溶液至吸附柱上，静置1min，10,000r/min离心30s，弃流出液；d)在吸附柱中加入700μL的洗涤液，12,000r/min离心30s，倒掉流出液；e)12,000r/min离心1min以除去残留液体，之后开口放置5min以除去吸附柱的乙醇；f)将吸附柱放入到一个干净的1.5mL离心管中，加入50μL经过65℃预热的Elution Buffer，静置1min，12,000r/min离心1min；g)离心管底部收集的液体即为纯化后的PCR产物，置于
‑
20℃保存；h)重复上述步骤依次再进行第二次、第三次纯化。3.根据权利要求2所述的一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于：对所得PCR产物切胶回收，切胶回收通过移液器配合纯化试剂盒，具体方法如下：a)将切下来的目的片段放入一个干净的1.5mL离心管中，并称量胶的重量；b)按照1:1的体积比向离心管中加入Binding Buffer；c)60℃水浴10min，在此过程中适当混匀离心管，使胶充分溶解；d)把上述溶液转移至吸附柱中，室温静置1min，12,000rpm离心1min，弃流出液；e)在离心柱中加700μL的洗涤液，12,000rpm离心1min，弃流出液；f)12,000rpm离心1min，彻底除去残留的洗涤液，之后开口放置5min以除去吸附柱中的乙醇；g)将吸附柱置于一个干净的1.5mL离心管中，在柱的中央加入50μLEB溶液，室温静置1min；h)12,000rpm离心1min，洗脱DNA，将洗脱得到的DNA置于4℃备用。4.根据权利要求1所述的一种构建纳米抗体文库的方法，其特征在于：电转感受态具体为：1)将纯化得到的连接体系加入TOP10感受态细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，陈彦羽，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：