一种酵母优化的工艺制备方法技术

本发明专利技术公开了一种酵母优化的工艺制备方法，包括，构建载体：对目的基因信号肽预测，去除信号肽序列，根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，基因合成至pPICZαA；目的基因信号肽预测采用SignalP 4.0和SignalP5.1预测；在对毕赤酵母表达系统进行密码子优化时，避开SacI酶切位点；当基因合成至pPICZαA时，目的基因紧挨着载体α

【技术实现步骤摘要】
一种酵母优化的工艺制备方法


[0001]本专利技术属于优化酵母
，具体涉及一种酵母优化的工艺制备方法。

技术介绍

[0002]大肠杆菌表达出来的蛋白质没有经过修饰，不一定具有天然的活性，且表达系统无法对表达时间以及表达水平进行调控，过量表达可能导致非生理反应，目前蛋白常以包涵体形式表达，导致纯化困难，使得整个制备方法操作流程复杂，表达产物产量低，为此我们提出一种酵母优化的工艺制备方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种酵母优化的工艺制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种酵母优化的工艺制备方法，包括，
[0005]构建载体：对目的基因信号肽预测，去除信号肽序列，根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，基因合成至pPICZαA；目的基因信号肽预测采用SignalP 4.0和SignalP5.1预测；
[0006]在对毕赤酵母表达系统进行密码子优化时，避开SacI酶切位点；
[0007]当基因合成至pPICZαA时，目的基因紧挨着载体α
‑
factor，C端带上6
×
His。
[0008]优选的，将毕赤酵母通过电转化成质粒状；
[0009]优选的，将目的载体线性化；
[0010]其中，将目的载体线性化包括如下步骤：
[0011](1)按下表配制载体酶切体系：
[0012]组分体积(ul)质粒(5
‑/>10ug)6ug10
×
buffer5SacI1ul碱性磷酸酶1ulddH2O补到50
[0013](2)37℃酶切过夜；
[0014](3)琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；
[0015](4)检测酶切成功后，65℃ 20min灭活。
[0016]优选的，将线性化载体纯化回收；
[0017]其中，将线性化载体纯化回收；包括以下步骤：
[0018](1)按下表配置载体纯化体系：
[0019]组分体积(ul)
酶切产物50核酸助沉剂103M NaAc，pH＝5.26无水乙醇165
[0020](2)
‑
20℃静置35min以上；
[0021](3)4℃12000rpm离心15min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；
[0022](4)加入400ul预冷的80％乙醇重悬沉淀；
[0023](5)4℃12000rpm离心10min，弃上清，开盖干燥；
[0024](6)加入10ulddH2O溶解沉淀。
[0025]优选的，制备酵母电转感受态；
[0026]其中，制备酵母电转感受态，包括以下步骤：
[0027]第一天：
[0028](1)50ml离心管中加入5mlYPD，接入X
‑
33菌株，30℃过夜培养；
[0029]第二天：
[0030](2)10
‑
12h后，转移50ul菌液至50mlYPD的250ml锥形瓶中，过夜培养至OD600＝1.3
‑
1.5；
[0031]第三天：
[0032](3)4℃4000rpm离心5min，用10mlbufferA重悬，30℃水浴15min，加入预冷的灭菌水至50ml；
[0033]bufferA：20mlYPD+2ml2MHEPES(pH＝8.0，过滤灭菌)+0.5ml1MDTT(过滤灭菌)；
[0034](4)4℃4000rpm离心5min，用50ml预冷的无菌水(含0.3ml2MHEPES，pH＝8.0)重悬；
[0035](5)4℃4000rpm离心5min，用4ml预冷的1Msorbitol重悬；
[0036](6)4℃4000rpm离心5min，用100ul预冷的1Msorbitol重悬，此时菌液呈粘稠状，80ul/管分装，至于冰上。
[0037]优选的，通过线性化载体电转酵母；
[0038]其中，通过线性化载体电转酵母包括以下步骤：
[0039](1)取80ul感受态细胞，加入6ug线性化pPICZαA
‑
gene，混匀后转移到预冷的0.2cm电击杯中；
[0040](2)冰上放置5min；
[0041](3)根据对酵母电击参数设置(1.5kV，25uF，200Ω)，电击；
[0042](4)立即加入2ml预冷的1M sorbitol+HEPES(10ml 1M sorbitol+100ul 2M HEPES，pH＝8.0)，转移至2ml无菌离心管中；
[0043](5)30℃静置孵育1
‑
2h；
[0044](6)分别稀释5倍、10倍、100倍后300ul/板涂布于15cm含有100mg/lZeocin的YPD平板上，30℃培养至长出克隆。
[0045]优选的，将转化子进行筛选；
[0046]其中，将转化子进行筛选包括以下步骤：
[0047](1)从平板上随机挑选24个克隆，进行菌落PCR；(菌落PCR使用的是本公司自主研发的一款快速扩增酵母克隆试剂盒，货号：RY8001)；
[0048](2)选择其中2个进行测序，比对正确后保留7个克隆待用。
[0049]优选的，转化子表达小试；
[0050]其中，转化子表达小试包括以下步骤：
[0051](1)准备7个50ml锥形瓶，分别加入5mlYPG培养基，分别接入上述验证正确的克隆，30℃220rpm培养1
‑
2天至菌液饱和；
[0052]YPG培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油；
[0053](2)转移到50ml离心管中，4000rpm离心5min，弃上清；
[0054](3)用5mlBMMY培养基重悬菌体，转移至新的无菌的50ml锥形瓶中，加入甲醇至终浓度为0.5％，28℃220rpm培养6d；
[0055]BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源，100mMPBS缓冲液(pH＝5.7)；
[0056](4)每隔24h加一次甲醇(终浓度为0.5％)；
[0057](5)第6d上午收集菌液，4000rpm离心5min，收集上清，用于表达鉴定。
[0058]优选的，转化子扩大表达。
[0059]其中，转化子扩大表达包括以下步骤：
[0060](1)250ml锥形瓶中加入50mlYPG培养基，接入最优表达转化子，30℃220rpm培养1
‑
2天至菌液饱和；
[0061](2)转移到50ml离心管中，4000rpm离心5min，弃上清；
[0062](3)用50mlBMMY培养基重悬菌体，转移至新的无菌的250ml锥形瓶中，加入甲醇至终浓度为0.5％，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母优化的工艺制备方法，其特征在于：包括，构建载体：对目的基因信号肽预测，去除信号肽序列，根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，基因合成至pPICZαA；将毕赤酵母通过电转化成质粒状；将目的载体线性化；将线性化载体纯化回收；制备酵母电转感受态；通过线性化载体电转酵母；将转化子进行筛选；转化子表达小试；转化子扩大表达。2.根据权利要求1所述的一种酵母优化的工艺制备方法，其特征在于：目的基因信号肽预测采用SignalP 4.0和SignalP5.1预测；在对毕赤酵母表达系统进行密码子优化时，避开SacI酶切位点；当基因合成至pPICZαA时，目的基因紧挨着载体α
‑
factor，C端带上6
×
His。3.根据权利要求1所述的一种酵母优化的工艺制备方法，其特征在于：其中，将目的载体线性化包括如下步骤：(1)按下表配制载体酶切体系：组分体积(ul)质粒(5
‑
10ug)6ug10
×
buffer5SacI1ul碱性磷酸酶1ulddH2O补到50(2)37℃酶切过夜；(3)琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；(4)检测酶切成功后，65℃20min灭活。4.根据权利要求1所述的一种酵母优化的工艺制备方法，其特征在于：其中，将线性化载体纯化回收；包括以下步骤：(1)按下表配置载体纯化体系：组分体积(ul)酶切产物50核酸助沉剂103M NaAc，pH＝5.26无水乙醇165(2)
‑
20℃静置35min以上；(3)4℃12000rpm离心15min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；(4)加入400ul预冷的80％乙醇重悬沉淀；(5)4℃12000rpm离心10min，弃上清，开盖干燥；
(6)加入10ulddH2O溶解沉淀。5.根据权利要求1所述的一种酵母优化的工艺制备方法，其特征在于：其中，制备酵母电转感受态，包括以下步骤：第一天：(1)50ml离心管中加入5mlYPD，接入X
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33菌株，30℃过夜培养；第二天：(2)10
‑
12h后，转移50ul菌液至50mlYPD的250ml锥形瓶中，过夜培养至OD600＝1.3
‑
1.5；第三天：(3)4℃4000rpm离心5min，用10mlbufferA重悬，30℃水浴15min，加入预冷的灭菌水至50ml；bufferA：20mlYPD+2ml2MHEPES(pH＝8.0，过滤灭菌)+0.5ml1MDTT(过滤灭菌)；(4)4℃4000rpm离心5min，用50ml预冷的无菌水(含0.3ml2MHEPES，pH＝8.0)重悬；(5)4℃4000rpm离心5min，用4ml预冷的1Msorbitol重悬；(6)4℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，陈彦羽，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：