一种利用酵母展示2019-nCoVS2蛋白的制作方法技术

本发明专利技术属于蛋白展示方法技术领域，公开了一种利用酵母展示2019

【技术实现步骤摘要】
一种利用酵母展示2019
‑
nCoV S2蛋白的制作方法


[0001]本专利技术属于蛋白展示方法
，具体涉及一种利用酵母展示2019
‑
nCoVS2蛋白的制作方法。

技术介绍

[0002]在噬菌体展示过程中，必须经过细菌转化噬菌体包装，有的还要经过跨膜分泌过程，大大限制了库容和分子多样性。同时不是所有的序列都能在噬菌体中很好的表达，因为有些蛋白功能的实现需要折叠、转运，导致体内选择压力增加。导致现有的酵母展示方法较为复杂，难以在短时间内表达出2019
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nCoV S2蛋白，为此我们提出一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，包括，
[0005]载体构建：将目的基因中取出信号肽序列，通过采用同源重组的方法构建载体；
[0006]载体转化酵母：获取YPDA平板，通过YPDA平板挑选EBY100单菌，并接种于YPDA液体，接着进行转接YPDA液体培养基，最终在30℃温度下培养4d；
[0007]其中，EBY100单菌为酿酒酵母,具有氨苄和卡纳抗性。质粒转化条件为电转化,应用于酵母表面展示。此菌株必须生长在营养丰富的培养基中,在GAL1启动子的作用下,能够表达AGA1基因，并与载体pYD1配套。
[0008]阳性克隆筛选：获取YPDA平板，并在YPDA平板上挑选8个克隆体，进行菌落PCR，选择其中两个成组进行测序；
[0009]其中，YPDA平板是培养基中常见的琼脂平板，是常见的实验工具之一。
[0010]诱导表达蛋白：将测序后的阳性单菌落，接种于含2％葡萄糖的YNB
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CAA液体培养基中，振荡培养，从而达到诱导目的蛋白表达。
[0011]所述载体构建中，目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和SignalP5.1进行预测；
[0012]其中，SignalP是一个信号肽预测服务器，它的功能是预测给定的氨基酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在，原核生物和真核生物都可以进行预测。而SignalP 4.0和SignalP5.1是目前服务器提供的版本之一。
[0013]并根据酿酒酵母表达系统进行密码子优化，合成目的基因。
[0014]优选的，所述载体转化酵母中：
[0015](1)其中，YPDA平板挑取EBY100单菌落接种于YPDA液体培养基为4ml，温度为30℃，转速为：225rpm，并且振荡培养18
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20h，其中OD600＞1.5；
[0016](2)接着将转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，温度为30℃，转速为225rpm，振荡培养4
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5h，使得OD600＝0.6。
[0017](3)接着继续转动，转速为4000rpm，转动时间为5min，弃上清；
[0018](4)用20ml无菌水重悬菌体，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；
[0019](5)用5ml的0.1MLiAc重悬菌体，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；
[0020](6)用500ul的0.1MLiAc重悬菌体，混匀，50ul/管，分装备用。
[0021](7)每管中依次加入如下试剂：
[0022]50％PEG33501MLiAcssDNA(20mg/ml)质粒DNA240ul36ul5ul5ul
[0023]并进行吹打混匀，或剧烈振荡，时间为40
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100s，至完全混匀。
[0024](8)30℃水浴孵育，30min；
[0025](9)42℃水浴热激，25min；
[0026](10)30℃水浴复苏，30min；
[0027](11)4000rpm离心5min，弃上清；
[0028](12)每个转化用200ul无菌水重悬菌体，温和混匀，涂布于SD
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Trp筛选平板；
[0029](13)30℃恒温培养4d。
[0030]优选的，所述诱导表达蛋白中：
[0031]培养时温度为30℃，转速为225rpm，振荡培养，至OD600＝2～5。接着进行4000rpm离心5min，弃上清。接着加入含2％半乳糖的YNB
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CAA培养基，吹打混匀，调整培养菌液至OD600＝0.5～1，30℃，225rpm，振荡培养72h以诱导目的蛋白的表达。
[0032]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0033]本专利技术通过酵母具有类似于高等真核生物的分泌途径，正确的质量控制机制确保分泌正确折叠的蛋白质。其次，酵母展示消除了表达引起的偏差。最后，酵母展示是多价展示，能够通过一次分选直接分选高、中、低亲和力的抗体，快速表达2019
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nCoV S2蛋白且固定在酵母细胞表面，后续可用于筛选相应的抗体，为疫苗生产提供帮助。
[0034]该方法通过酵母展示技术，成功把2019
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nCoV S2蛋白展示在酵母表面。
附图说明
[0035]图1为本专利技术的方法流程示意图；
[0036]图2为本专利技术的试管中加入试剂表格示意图；
具体实施方式
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]请参阅图1、图2，本专利技术提供一种技术方案：
[0039]一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，包括，
[0040]载体构建：将目的基因中取出信号肽序列，通过采用同源重组的方法构建载体；
[0041]载体转化酵母：获取YPDA平板，通过YPDA平板挑选EBY100单菌，并接种于YPDA液体，接着进行转接YPDA液体培养基，最终在30℃温度下培养4d；
[0042]其中，EBY100单菌为酿酒酵母,具有氨苄和卡纳抗性。质粒转化条件为电转化,应用于酵母表面展示。此菌株必须生长在营养丰富的培养基中,在GAL1启动子的作用下,能够表达AGA1基因，并与载体pYD1配套。
[0043]阳性克隆筛选：获取YPDA平板，并在YPDA平板上挑选8个克隆体，进行菌落PCR，选择其中两个成组进行测序；
[0044]其中，YPDA平板是培养基中常见的琼脂平板，是常见的实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，其特征在于：包括，载体构建：将目的基因中取出信号肽序列，通过采用同源重组的方法构建载体；载体转化酵母：获取YPDA平板，通过YPDA平板挑选EBY100单菌，并接种于YPDA液体，接着进行转接YPDA液体培养基，最终在30℃温度下培养4d；阳性克隆筛选：获取YPDA平板，并在YPDA平板上挑选8个克隆体，进行菌落PCR，选择其中两个成组进行测序；诱导表达蛋白：将测序后的阳性单菌落，接种于含2％葡萄糖的YNB
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CAA液体培养基中，振荡培养，从而达到诱导目的蛋白表达。2.根据权利要求1所述的一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，其特征在于：所述载体构建中，目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和SignalP5.1进行预测；并根据酿酒酵母表达系统进行密码子优化，合成目的基因。3.根据权利要求1所述的一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，其特征在于：所述载体转化酵母中：其中，YPDA平板挑取EBY100单菌落接种于YPDA液体培养基为4ml，温度为30℃，转速为：225rpm，并且振荡培养18
‑
20h，其中OD600>1.5；接着将转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，温度为30℃，转速为225rpm，振荡培养4
‑
5h，使得OD600＝0.6。4.根据权利要求1所述的一种利用酵母展示2019
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nCoV S2蛋白的制作方法，其特征在于：接着继续转动，转速为4000rpm，转动时间为5min，弃上清；用20ml无菌水重悬菌体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，陈彦羽，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：