一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法技术

本发明专利技术涉及蛋白表达技术领域，具体为一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，该方法包含有菌株的保存与培养、试剂的配置，方法包含有蛋白质可行性分析构建载体、目的基因的克隆与重组质粒、大肠杆菌感受态的制备转化、毕赤酵母电转感受态的制备转化、蛋白鉴定。该基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，蛋白质可行性分析先构建载体，然后目的基因的克隆与重组质粒，在这一过程中进行大肠杆菌感受态的制备、大肠杆菌感受态的转化、毕赤酵母电转感受态的制备与毕赤酵母感受态电击转化，制备结束过后进行蛋白表达与鉴定、最终进行蛋白表达鉴定，从而得出蛋白可以表达，该种方式进一步加深了人们对于酵母外泌蛋白表达领域的研究。蛋白表达领域的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法


[0001]本专利技术涉及蛋白表达
，具体为一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法。

技术介绍

[0002]蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术，在基因工程技术中占有核心地位，蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的，一般由宿主、载体、辅助成分组成，当下对于酵母蛋白的外泌表达研究尚未深入，有许多的具体操作步骤往往不够成熟，为此现提出一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法来弥补对与酵母外泌蛋白表达领域的不足。

技术实现思路

[0003]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，由以下具体技术手段所达成：
[0004]本专利技术为实现技术目的采用如下技术方案：一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：
[0005]包含有材料的准备与方法及结果分析；
[0006]所述材料的准备包含有菌株的保存与培养、试剂的配置；
[0007]所述方法包含有以下步骤：
[0008]S100、蛋白质可行性分析；
[0009]S101、构建载体，目的基因的克隆与重组质粒；
[0010]S102、大肠杆菌感受态的制备；
[0011]S103、大肠杆菌感受态的转化；
[0012]S104、毕赤酵母电转感受态的制备；
[0013]S105、毕赤酵母感受态电击转化；
[0014]S106、蛋白表达、纯化与鉴定；
[0015]S107、蛋白鉴定；
[0016]S108、结果与分析；
[0017]S109、蛋白表达鉴定，从而得出蛋白可以表达。
[0018]优选的，所述菌株的保存与培养是大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20％的甘油菌于
‑
80℃冷冻保存，毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115于YPD培养液摇菌后保存成30％的甘油菌于
‑
80℃冷冻保存，大肠杆菌于37℃培养箱中培养，毕赤酵母于28℃培养箱中培养。
[0019]优选的，所述试剂的配制包含有LB培养基、TB buffer、YPG培养基与BMMY培养基。
[0020]优选的，所述大肠杆菌感受态的制备包含以下步骤：
[0021]S200、从甘油菌中活化TOP10，37℃培养；
[0022]S201、挑单菌落摇菌，37℃200rpm过夜；
[0023]S202、按1：50或1：100扩培到100ml LB液体培养基中，22℃200rpm 4h左右；
[0024]S203、待0D600＝0.2
‑
0.3时，置于冰上10min；
[0025]S204、4℃3000rpm离心10min收集菌体，弃上清；
[0026]S205、15ml TB Buffer悬浮，冰上放置10min(TB Buffer预先于冰上预冷)；
[0027]S206、4℃3000rpm离心10min收集菌体，弃上清；
[0028]S207、用10ml感受态液体悬浮(0.6ml DMSO+7.4ml TB)；
[0029]S208、按100μl/管分装至1.5ml EP管中，冰上操作，分装后迅速放于
‑
70℃保存。
[0030]优选的，所述大肠杆菌感受态的转化的操作步骤如下：
[0031]S300、吸取10μl重组质粒到感受态细胞中，冰上放置30min；
[0032]S301、42℃热激90s，冰上放置5min；
[0033]S302、于超净台中加入800μl LB液体培养基，37℃220rpm复苏1h；
[0034]S303、4000rpm离心5min，保留100μl LB悬浮菌体，涂布于相应抗生素的LB固体平板上，37℃过夜培养。
[0035]优选的，所述毕赤酵母电转感受态的制备具体步骤如下：
[0036]S400、从新鲜划线培养的P.pastoris GS115平板上接单菌落，转移至50ml液体YPG培养基中，30℃200rpm培养至OD600＝1.0
‑
1.5之间；
[0037]S401、4000rpm离心5min收集菌体，用10ml酵母感受态母液重悬，室温静置30min，每隔10min轻柔颠倒混匀；4000rpm离心5min收集菌体；
[0038]S402、用10ml预冷的1M山梨醇重悬，然后4℃4000rpm离心5min，收集菌体；
[0039]S403、重复上述步骤3次；
[0040]S404、最后用200μl预冷的1M山梨醇重悬，分装至1.5ml离心管中，每管80μl，可直接使用或保存于
‑
80℃；
[0041]S405、酵母感受态母液：10mM Tris
‑
HCl，0.6M山梨醇，10mM DTT，100mM LiAc，pH7.5.过滤除菌；
[0042]优选的，所述毕赤酵母感受态电击转化操作步骤如下：
[0043]S500、冰浴预冷0.2cm电击杯，打开电击仪，调整电转参数：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF；
[0044]S501、向制备好的酵母感受态细胞中加入2
‑
5μg DNA片段，轻柔吸打混匀后转移至电击杯中，冰浴5min；
[0045]S502、进行电转操作，电击结束后立刻向电击杯中加入1ml预冷的1M山梨醇，并吸打混匀，然后转移至1.5ml离心管中，于30℃培养箱中静置培养1h；
[0046]S503、室温下4000rpm离心4min，收集菌体，并用100μl YPG重悬；
[0047]S504、将细胞悬浮液涂布在含有100μg/ml Zeocin的YPG平板上，30℃下培养3
‑
5天；
[0048]优选的，所述蛋白诱导表达具体流程如下：
[0049]S600、接种多个酵母单菌落于20ml YPG中，30℃220rpm培养2d至菌液饱和；
[0050]S601、4000rpm离心5min，收集菌体，用20ml BMMY重悬；
[0051]S602、加入0.75％(即150μl)甲醇诱导表达，之后每隔24h补加一次甲醇，一共需要加5次，25℃220rpm诱导表达；
[0052]S603、第6天，室温4000rpm离心5min收集上清，即为酵母外泌表达蛋白；
[0053]S604、分别进行考染与WB检测蛋白表达情况。
[0054]优选的，所述蛋白鉴定包含有WB检测，具体包含以下步：
[0055]S700、取20μl蛋白溶液进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：包含有材料的准备与方法及结果分析；所述材料的准备包含有菌株的保存与培养、试剂的配置；所述方法包含有以下步骤：S100、蛋白质可行性分析；S101、构建载体，目的基因的克隆与重组质粒；S102、大肠杆菌感受态的制备；S103、大肠杆菌感受态的转化；S104、毕赤酵母电转感受态的制备；S105、毕赤酵母感受态电击转化；S106、蛋白表达、纯化与鉴定；S107、蛋白鉴定；S108、结果与分析；S109、蛋白表达鉴定，从而得出蛋白可以表达。2.根据权利要求1所述的一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：所述菌株的保存与培养是大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20％的甘油菌于
‑
80℃冷冻保存，毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115于YPD培养液摇菌后保存成30％的甘油菌于
‑
80℃冷冻保存，大肠杆菌于37℃培养箱中培养，毕赤酵母于28℃培养箱中培养。3.根据权利要求1所述的一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：所述试剂的配制包含有LB培养基、TB buffer、YPG培养基与BMMY培养基。4.根据权利要求1所述的一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：所述大肠杆菌感受态的制备包含以下步骤：S200、从甘油菌中活化TOP10，37℃培养；S201、挑单菌落摇菌，37℃200rpm过夜；S202、按1：50或1：100扩培到100ml LB液体培养基中，22℃200rpm 4h左右；S203、待0D600＝0.2
‑
0.3时，置于冰上10min；S204、4℃3000rpm离心10min收集菌体，弃上清；S205、15ml TB Buffer悬浮，冰上放置10min(TB Buffer预先于冰上预冷)；S206、4℃3000rpm离心10min收集菌体，弃上清；S207、用10ml感受态液体悬浮(0.6ml DMSO+7.4ml TB)；S208、按100μl/管分装至1.5mlEP管中，冰上操作，分装后迅速放于
‑
70℃保存。5.根据权利要求1所述的一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：所述大肠杆菌感受态的转化的操作步骤如下：S300、吸取10μl重组质粒到感受态细胞中，冰上放置30min；S301、42℃热激90s，冰上放置5min；S302、于超净台中加入800μl LB液体培养基，37℃220rpm复苏1h；S303、4000rpm离心5min，保留100μl LB悬浮菌体，涂布于相应抗生素的LB固体平板上，37℃过夜培养。
6.根据权利要求1所述的一种基于毕赤酵母GS115培养的酵母外泌蛋白表达方法，其特征在于：所述毕赤酵母电转感受态的制备具体步骤如下：S400、从新鲜划线培养的P.pastoris GS115平板上接单菌落，转移至50ml液体YPG培养基中，30℃200rpm培养至OD600＝1.0
‑
1.5之间；S401、4000rpm离心5min收集菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：