一种同时提取病原体DNA和RNA的试剂盒及其应用制造技术

本申请涉及核酸提取的技术领域，具体公开了一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂及提取试剂盒；提取试剂包括蛋白酶K，裂解液，磁珠液，洗涤液Ⅰ，洗涤液Ⅱ和洗脱液；所述裂解液包括以下组分：pH6.0～8.0的10～100mmol/L Tris

【技术实现步骤摘要】
一种同时提取病原体DNA和RNA的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于核酸提取的
，具体涉及一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂及提取试剂盒。

技术介绍

[0002]从生物样品中提取核酸是基因工程学或临床检验领域中的重要过程，目前，提取核酸的方法有很多种，其中，磁珠法提取核酸因其能实现高通量、自动化操作，且具有操作简单，安全无毒等优点，现已得到广泛应用。
[0003]磁珠法提取核酸的原理是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，在外加磁场的作用下，使磁性颗粒与液体分开，弃除液体后，再经洗脱得到纯化的核酸分子。
[0004]在磁珠法提取核酸技术中，相关技术能够单一提取DNA或RNA。但是该方法中，能够实现对DNA和RNA的同时提取。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术公开了一种提高核酸提取的效率的同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂及提取试剂盒。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂，包括裂解液、磁珠液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液和蛋白酶K；所述裂解液包括以下组分：10～100mmol/L pH6.0～7.0的Tris
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HCl、1～6M的胍盐、0.1～5Vol％的十二烷基硫酸钠、0.5～3Vol％的吐温20、1～10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～5M的异丙醇，溶剂为水。
[0008]进一步优选地，提取试剂中，裂解液600ul、磁珠液600ul、洗涤液Ⅰ800ul、洗涤液Ⅱ800ul、洗脱液100ul和蛋白酶K 20ul。
[0009]进一步地，所述胍盐选自盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、硫氰酸胍和异硫氰酸胍中的至少一种。乙二胺四乙酸二钠为酶抑制剂。十二烷基硫酸钠为阴离子表面活性剂。
[0010]进一步地，所述磁珠液包括15～25mg/mL的磁性微球，0.3～0.8mol/L氯化钠、5～30mmol/LpH7.0～7.5的Tris
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HCl，溶剂为水。所述磁性微球为特定羟基修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠。
[0011]进一步地，所述洗涤液Ⅰ包括5～30mmol/L pH7.0～7.5的Tris
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HCl、1～10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、100～200mmol/L氯化钠、0.5M～5M的胍盐、50～70Vol％的乙醇溶液，溶剂为水。
[0012]进一步地，所述洗涤液Ⅱ包括50～75Vol％乙醇溶液；所述洗脱液包括水。
[0013]进一步地，所述蛋白酶K为20μg/μL蛋白酶K溶液。
[0014]本专利技术还提供一种同时提取病原体DNA和RNA的试剂盒，包括上述的提取试剂。
[0015]本专利技术还提供了一种同时提取病原体DNA和RNA的提取方法，包括以下步骤：
[0016](1)96孔板中每孔加入200μL模拟病原体生物样本及20μL的20μg/μL蛋白酶K溶液，
[0017](2)随后放入提取仪(BNP32)中，安装好磁棒保护套，运行程序，具体程序如下表所示：
[0018]全自动核酸提取程序：
[0019]步骤孔位名称混合时间磁吸时间混合速度容积(mL)温度(℃)14磁珠准备00：3000：30快200021裂解04：0000：30快8007532洗涤Ⅰ00：3000：30快800043洗涤Ⅱ01：0000：30快800055洗脱03：0000：30慢1006563磁珠回收00：3000：00快8000
[0020]本专利技术的有益效果为：
[0021](1)用本专利技术所述的试剂盒提取DNA和RNA后，提取后的DNA和RNA纯度较高。
[0022](2)用本专利技术所述的试剂盒提取DNA和RNA后，提取后的DNA和RNA浓度较高。
附图说明
[0023]图1为实施例1
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5中核酸提取产物检测DNA病毒的QPCR扩增曲线图；
[0024]图2为实施例1
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5中核酸提取产物检测RNA病毒的QPCR扩增曲线图；
[0025]图3为对比例1
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3中核酸提取产物检测DNA病毒的QPCR扩增曲线图；
[0026]图4为对比例1
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3中核酸提取产物检测RNA病毒的QPCR扩增曲线图；。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本专利技术，应理解下述具体实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0028]在本专利技术磁珠法提取核酸反应体系中，核酸提取技术采用经过特定羟基修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠(常州天地人和生物科技有限公司，MagSilica Beads磁珠)，在高浓度胍盐、钠盐离子和低PH溶液(提取试剂)条件下能够同核酸发生吸附反应，使核酸分子特异性的吸附到磁珠表面。将吸附有核酸分子的磁珠转移至洗脱液Ⅰ、洗涤液Ⅱ中，在洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ中除去蛋白、盐离子及其他小分子化合物杂质。洗涤完成后，将吸附有核酸分子的磁珠转移至水溶液中洗脱。
[0029]以咽拭子样本为例，结合本专利技术的技术方案详细说明本专利技术的具体实施方式。
[0030]以下实施例中，若非特殊说明，各原料均为普通市售。
[0031]实施例1
[0032]病原体生物样本的核酸提取1
[0033]样本制备
[0034]样本母液制备：分别取高浓度肺炎链球菌(DNA)菌液及副流感病毒培养物(RNA)500μL于15mL离心管中混合，用无核酸酶水稀释10倍备用；
[0035]阴性咽拭子溶液制备：使用空白咽拭子保存液，取健康人阴性咽拭子样本于保存
液中，获得阴性咽拭子溶液；
[0036]模拟病原体生物样本制备：用上述阴性咽拭子溶液将样本母液稀释10倍，制备获得模拟的病原体生物样本。
[0037]提取试剂制备
[0038]裂解液(pH7.0)：Tris
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HCl(40mmol/L)、盐酸胍(1M)、十二烷基硫酸钠(0.5Vol％)、吐温20(1.5Vol％)、乙二胺四乙酸二钠(70mmol/L)、异丙醇(2M)，溶剂为水；
[0039]磁珠液：磁性微球(20mg/mL)，氯化钠(1mol/L)、Tris
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HCl(pH7.5，10mmol/L)，溶剂为水；磁性微球为特定羟基修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，(常州天地人和生物科技有限公司，MagSilica Beads磁珠)；
[0040]洗涤液Ⅰ(pH7.0)：Tris
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HCl(15mmol/L)、乙二胺四乙酸二钠(10mmol/L)、氯化钠150mmol/L)、盐酸胍(2M)、乙醇溶液(60Vol％)，溶剂为水；
[0041]洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂，其特征在于，包括裂解液、磁珠液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液和蛋白酶K；所述裂解液包括以下组分：10～100mmol/L pH6.0～7.0的Tris
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HCl、1～6M的胍盐、0.1～5Vol％的十二烷基硫酸钠、0.5～3Vol％的吐温20、1～10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～5M的异丙醇，溶剂为水。2.根据权利要求1所述的一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂，其特征在于，所述胍盐为盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、硫氰酸胍和异硫氰酸胍中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂，其特征在于，所述磁珠液包括15～25mg/mL的磁性微球，0.3～0.8mol/L氯化钠、5～30mmol/L pH7.0～7.5的Tris
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HCl，溶剂为水。4.根据权利要求1所述的一种同时提取病原体DNA和RNA的提取试剂，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊永清，闫泉，张浩淼，甄博文，王洪，戴海峰，高凡，
申请(专利权)人：爱科睿特生物医疗科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：