本发明专利技术公开了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：（1）合成透明质酸衍生物；（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。本发明专利技术的优点在于：1、对核酸药物磷酸钙核心外包被透明质酸衍生物，抑制核心不可控生长，粒径均一稳定在200nm左右；2、混合法制备，时间短，成本降低，且没有实用有机溶剂，清洁无污染；3、生物相容性更好，使用的材料为广泛应用到临床的药用辅料透明质酸和临床在用药物阿仑膦酸钠，安全性好。安全性好。安全性好。
【技术实现步骤摘要】
透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用
[0001]本专利技术属于纳米生物材料领域，具体涉及透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用。
技术介绍
[0002]磷酸钙纳米粒作为一种具备良好生物安全性和降解性的天然材料，在转染核酸药物（siRNA、DNA、mRNA等）治疗疾病的研究中表现出较好的递送效率。然而，磷酸钙纳米粒在生理环境下快速不可控生长的粒径使得其难以在肿瘤等病灶部位蓄积，严重限制了其运用到临床的进程。
[0003]针对磷酸钙纳米粒不可控的粒径增长问题，目前的改良手段主要的方法是以磷酸钙/核酸药物纳米沉淀为核心，通过连接键覆盖阻碍其粒径持续增长的保护外层，主要包括脂质材料（Lipid）、PEG、黏多糖和PLGA及其他无机材料。比较有代表性的是利用Lipid层控制磷酸钙纳米粒粒径生长，使用反相微乳法制备了核酸药物/磷酸钙纳米粒（Lipid coated calcium phophate
‑
1，LCP
‑
1）。其中，反相微乳是由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚 （IGEPAL
‑
CO
‑
520）的环己烷油相溶液中制备得到，主要分三步：1）将CaCl2溶液（pH=9）和核酸药物/NaHPO4（pH=9）混合溶液分别分散到油相中，将两相混合搅拌，微乳交换反应产生包载siRNA的磷酸钙沉淀；2）加入柠檬酸钠直至溶液澄清稳定磷酸钙纳米粒（粒径在 80 nm左右），同时使纳米粒表面呈负电性，利于与阳离子脂质体结合。乙醇水洗脱并过硅胶柱方法纯化；3）进一步与阳离子磷脂1,2
‑
二油烯氧基3
‑
三甲氨基丙烷（DOTAP）/胆固醇作用，得到粒径约为150 nm 的LCP
‑
1纳米粒。
[0004]但是上述的制备方法有两大缺陷与不足：1）操作工艺复杂；2）使用有机溶剂，成本高。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：本专利技术针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本专利技术公开了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用。本专利技术首先合成了透明质酸衍生物材料，然后通过简单混合法，构建了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒，本专利技术只需简单混合操作，制备方便，且不涉及有机溶剂，成本低廉，更安全。
[0006]技术方案：透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：（1）合成透明质酸衍生物：（11）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的透明质酸和0.9～ 1.8摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值调节至4～5；（12）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在18 ～ 25 ℃下反应24 ～ 72 h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在37 ～ 40 ℃下孵育0.5～1h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
[0007]进一步地，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为48kD ～ 780kD，优选48kD。
[0008]进一步地，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU和1
‑
羟基苯并三氮唑的混合物，或者：等摩尔比的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺的混合物。
[0009]进一步地，步骤（11）中所述溶剂为去离子水、DMF、DMSO中的一种，优选去离子水。
[0010]进一步地，步骤（11）中将混合液的pH值调节至4.8。
[0011]进一步地，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为阿仑膦酸钠、帕米膦酸二钠中的一种，优选阿仑膦酸钠。
[0012]进一步地，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为100 ～ 500mmol
•
L
‑1，优选250mmol
•
L
‑1。
[0013]进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为siRNA、mRNA、DNA中的一种。
[0014]更进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为1 ～ 50 μmol
•
L
‑1。
[0015]进一步地，步骤（22）中所述缓冲液为HEPES 缓冲液或PBS缓冲液，优选的为HEPES 缓冲液。
[0016]进一步地，步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为0.5～ 1.5 mg/mL。
[0017]进一步地，所述步骤（23）中透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒中磷酸钙包括磷酸三钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢钙和磷酸八钙。
[0018]上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0019]上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
[0020]有益效果：本专利技术公开的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用的优点在于：1、对核酸药物磷酸钙核心外包被透明质酸衍生物，抑制核心不可控生长，粒径均一稳定在200nm左右；2、混合法制备，时间短，成本降低，且没有实用有机溶剂，清洁无污染；3、生物相容性更好，使用的材料为广泛应用到临床的药用辅料透明质酸和临床在用药物阿仑膦酸钠，安全性好。
附图说明
[0021]图1为透明质酸
‑
阿仑膦酸钠（HL）的核磁共振氢谱图。
[0022]图2为不同阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA粒径分布图。
[0023]图3为HL@CAP/siRNA纳米粒（P%=80%）的DLS粒径图。
[0024]图4为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的透射电镜图。
[0025]图5为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA对siRNA的血清保护效果图。
[0026]图6为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的放置稳定性示意图。
[0027]图7为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的稀释稳定性图。
[0028]图8为HL@CAP/siRNA与商用转染试剂Lipofectamine2000的细胞摄取能力对比示意图。
[0029]具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式详细说明。
[0030]实施例1：透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：（1）、合成透明质酸
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阿仑膦酸钠共轭物（HL）首先，于100 mL茄形瓶中加入200 mg（0.5 mmol）透明质酸（H本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）合成透明质酸衍生物：（11）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的透明质酸和0.9～ 1.8摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值调节至4～5；（12）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在18 ～ 25 ℃下反应24 ～ 72 h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在37 ～ 40 ℃下孵育0.5～1h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。2.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU和1
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羟基苯并三氮唑的混合物，或者：等摩尔比的1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺的混合物。3.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为48kD ～ 780kD；步骤（11）中将混合液的pH值调节至4.8。...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱崇，夏斐，史巧莉，郭秋岩，张珺哲，王继刚，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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