一种δ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法技术

本发明专利技术公开了一种δ株2019

【技术实现步骤摘要】
一种
δ
株2019
‑
nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种δ株2019
‑
nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法。

技术介绍

[0002]2019
‑
nCoV为正链RNA病毒，基因组大小约30kb，属于冠状病毒的β属。人体感染冠状病毒后常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等；在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡等。
[0003]2019
‑
nCoV的表面蛋白(S蛋白)参与和宿主细胞膜受体(ACE
‑
2)结合的功能，决定病毒的宿主范围和特异性。因此，S蛋白在疫苗开发或治疗性药物开发中是关键的靶点：1)宿主中和抗体的重要作用位点；2)疫苗设计的关键靶点。目前，表面蛋白(S)的受体结合区(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域，能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。
[0004]2019
‑
nCoV作为单链RNA病毒，基因组不稳定，随着感染群体增加，进化出诸多优势毒株。2021年5月，世卫组织将最早在印度发现的2019
‑
nCoV变异毒株B.1.617.2命名为δ株；该突变株为潜伏期短、传播速度快、病毒载量高、核酸转阴时间长、更易发展为危重症等特点。因此，开发针对δ株2019
‑
nCoV的疫苗具有重要的经济和社会价值。
[0005]2019
‑
nCoV的S蛋白的RBD作为关键免疫原，采用分泌表达具有显著优势：1)分泌表达上清纯化工艺简单；2)可溶性表达；3)信号肽酶精准切割，N端无冗余Met残基，产生符合预期的蛋白序列。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种δ株2019
‑
nCoV的表面蛋白(S蛋白)受体结合区(RBD)制备方法。
[0007]为解决上述问题，本专利技术采用人工改造信号肽(信号肽H，SEQ ID No.1)引导δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD分泌至培养上清，经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于S蛋白天然信号肽(信号肽S)。
[0008]第一方面，本专利技术要求保护SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
[0009]P1、提高δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD在宿主细胞中的分泌表达产量；
[0010]P2、提高δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD在宿主细胞中的分泌表达效率；
[0011]P3、制备δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD分泌蛋白制品；
[0012]所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
[0013]进一步地，所述宿主细胞可为真核宿主细胞。如：HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
[0014]在本专利技术的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
[0015]进一步地，所述编码基因可为如下任一：
[0016](a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0017](a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
[0018](a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。
[0019]上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0020]上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％或98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％或94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％或89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％或84％的同一性。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.5所示DNA片段(SEQ ID No.5的第1
‑
57位为信号肽H的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如Hind III和Pac I)后得到的重组质粒。
[0022]第二方面，本专利技术要求保护一种融合蛋白。
[0023]本专利技术要求保护的融合蛋白为将SEQ ID No.1所示多肽融合于δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD的N端后所得。
[0024]进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1
‑
242位或第1
‑
247位所示或如SEQ ID No.4所示。
[0025]SEQ ID No.4的第1
‑
19位为信号肽H(即SEQ ID No.1)，第20
‑
242位为所述δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD，第243
‑
247位为Linker接头，第248
‑
253位为组氨酸标签。
[0026]第三方面，本专利技术要求保护编码前文第二方面所述融合蛋白的核酸分子。
[0027]进一步地，所述核酸分子自5
’
端到3
’
端依次由SEQ ID No.1所示多肽的编码基因和δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD的编码基因组成。
[0028]更进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因可为如下任一：
[0029](a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0030](a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
[0031](a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。
[0032]更进一步地，所述δ株2019
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：P1、提高δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD在宿主细胞中的分泌表达产量；P2、提高δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD在宿主细胞中的分泌表达效率；P3、制备δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD分泌蛋白制品；所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为真核宿主细胞。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下任一：(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。4.融合蛋白，为将SEQ ID No.1所示多肽融合于δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD的N端后所得。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1
‑
242位或第1
‑
247位所示或如SEQ ID No.4所示。6.编码权利要求4或5所述融合蛋白的核酸分子。7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子自5
’
端到3
’
端依次由SEQ ID No.1所示多肽的编码基因和δ株2019
‑
nCoV的S蛋白RBD的编码基因组成；进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因为如下任一：(a1)SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，安文琪，王斌，邢体坤，宋路萍，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：