用于癌症的纤连蛋白额外结构域B(EDB)特异性CAR-T制造技术

本发明专利技术提供了对纤连蛋白额外结构域B(EDB)具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)，可用于免疫细胞(如T细胞和NK细胞)的改造以治疗诸如癌症和炎性疾病。癌症和炎性疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症的纤连蛋白额外结构域B(EDB)特异性CAR
‑
T

技术介绍

[0001]嵌合抗原受体(CAR)是将抗原结合和免疫细胞(例如T细胞)激活功能结合到单一受体中的工程化受体，然后赋予具有这种工程化受体的免疫细胞靶向特定蛋白质的新能力。
[0002]CAR近来已应用于癌症治疗的疗法中，其基于修饰的T细胞具有新获得的识别癌细胞上癌症抗原的能力，以便更有效地靶向和破坏它们。通常从需要CAR
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T疗法的患者身上获取自体T细胞，然后离体将CAR引入到T细胞中，然后将所得的CAR
‑
T细胞输回患者体内，以攻击带有CAR识别抗原的肿瘤。
[0003]CAR
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T细胞既可以来自患者自身血液中的T细胞(自体)，也可以来自另一位健康供体的T细胞(异体)。为了安全起见，优选将CAR
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T细胞改造成对在肿瘤上表达而在健康细胞上不表达的抗原具有特异性。一旦将CAR
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T细胞输入患者体内，它们成为对抗癌细胞的“活药物”，与癌抗原结合并被激活，开始增殖并发挥对抗癌细胞的细胞毒性。
[0004]CAR
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T细胞的改造可通过多种方式增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，包括T细胞受刺激后的增殖能力的加强，对于其他活细胞的细胞毒性作用加强，多种活性因子如细胞因子，白介素，生长因子的分泌增加。
[0005]近年来，CAR
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T细胞免疫疗法在治疗恶性血液肿瘤方面取得了非常有效的结果。尽管在血液瘤治疗中CARr/>‑
T疗法取得了重大进展，但是CAR
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T疗法在实体瘤中的应用却挑战重重，包括CAR
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T疗法在实体瘤治疗中的遇到的特异性、持久性、安全性和免疫抑制性微环境等问题，限制了CAR
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T疗法更广泛的临床应用。因此我们需要更可靠，安全，有效的CAR
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T疗法，克服目前CAR
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T细胞在实体瘤中的限制，使其能扩展到包括实体瘤在内的更广泛的肿瘤的治疗。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：(1)对纤连蛋白额外结构域B(EDB)具有特异性的抗原结合结构域；以及(2)选自CD3、CD4、CD8、CD28、OX40或CD137膜蛋白的跨膜(TM)结构域；和(3)具有或不具有共刺激结构域的CD3ζ细胞内ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)结构域；其在T细胞表面表达时，CAR与(a)可溶性EDB，(b)膜结合的EDB和/或(c)细胞外基质中的EDB结合(例如，纤连蛋白网状结构的组成成分，起到细胞附着支架的作用)后能够激活T细胞。
[0007]在某些实施方案中，抗原结合结构域是单链抗体(scFv)、纳米抗体(例如，VHH(驼科动物Ig)的衍生物)、单域抗体(dAb，VH或VL结构域的衍生物)、双特异性T细胞衔接器(BiTE，双特异性抗体)和双亲和力再靶定(Dual Affinity ReTargeting，DART，双特异性抗体))；抗运载蛋白(脂蛋白的衍生物)；Adnectin(第10个FN3(纤连蛋白))；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)；或者亲和性多聚体。
[0008]在某些实施方案中，抗原结合结构域是人scFv或人源化scFv。
[0009]在某些实施方案中，CAR进一步包含在抗原结合结构域和TM结构域之间的铰链/间
隔结构域。
[0010]在某些实施方案中，铰链/间隔结构域和TM域源自相同的蛋白质。
[0011]在某些实施方案中，相同的蛋白质是CD8α，并且其中铰链/间隔结构域是CD8α的胞外结构域。
[0012]在某些实施方案中，(3)包括共刺激域。
[0013]在某些实施方案中，共刺激结构域来自于CD28。
[0014]在某些实施方案中，(3)包括两个共刺激域。
[0015]在某些实施方案中，两个共刺激结构域包括来自CD28的共刺激结构域，和/或来自CD27、4
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1BB或OX
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40的共刺激结构域。
[0016]在某些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：1的残基21
‑
236的scFv、CD8α细胞外和跨膜结构域、4
‑
1BB胞内结构域和CD3zeta胞内结构域。
[0017]在某些实施方案中，CAR进一步包含N端信号肽序列(例如hIL
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2信号肽序列，或SEQ ID NO：1的残基1
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20)。
[0018]在某些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：1的多肽。
[0019]本专利技术的另一方面提供了编码本专利技术的CAR的多核苷酸。例如，多核苷酸可以是SEQ ID NO：2。
[0020]在某些实施方案中，多核苷酸经密码子优化以在人细胞中表达。
[0021]本专利技术的另一方面提供了包含本专利技术的多核苷酸的载体。
[0022]在某些实施方案中，载体是能够在T细胞、巨噬细胞和/或NK细胞，例如原代人T细胞、巨噬细胞或NK细胞中感染和/或表达所述CAR的病毒载体。
[0023]在某些实施方案中，载体是能够在外周单核细胞、单核细胞衍生的树突细胞、造血干细胞和/或诱导的PSC(多能干细胞)中感染和/或表达所述CAR的病毒载体。
[0024]在某些实施方案中，载体是慢病毒载体。
[0025]在某些实施方案中，慢病毒载体是自失活的慢病毒载体。
[0026]本专利技术的另一方面提供了表达本专利技术的CAR的细胞，其包含本专利技术的多核苷酸或本专利技术的载体。
[0027]在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。
[0028]在某些实施方案中，细胞是T细胞。
[0029]在某些实施方案中，细胞是NK细胞。
[0030]在某些实施方案中，细胞是单核细胞或巨噬细胞。
[0031]在某些实施方案中，细胞是从患者中分离的原代细胞。
[0032]在某些实施方案中，细胞来自已建立的细胞系，例如对于要向其施用细胞的患者的同种异体细胞系。
[0033]在某些实施方案中，细胞表达细胞因子。
[0034]在某些实施方案中，细胞因子包含IL
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2、IL
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7、IL
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12、IL
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15或IL
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21。
[0035]在某些实施方案中，细胞因子的表达受通过免疫细胞活化而活化的启动子的控制。
[0036]在某些实施方案中，细胞还包括用于下调免疫细胞活性的安全开关。
[0037]在某些实施方案中，安全开关包含iCaspase9(诱导型caspase
‑
9)单体的编码序
列，其可以通过用例如FKBP二聚体而被激活，以触发免疫细胞的凋亡。
[0038]本专利技术的另一方面提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(1)对纤连蛋白胞外结构域B(EDB)具有特异性的抗原结合结构域；(2)选自CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD4、CD8、CD28、OX40或CD137膜蛋白的胞外结构域和/或跨膜(TM)结构域；和(3)具有或不具有共刺激结构域的CD3ζ细胞内ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)结构域；其中，当所述CAR在T细胞表面表达时，所述CAR在(a)与可溶性EDB结合后，(b)与膜结合的EDB结合后，和/或(c)与细胞外基质(例如，作为细胞附着支架的纤连蛋白网状结构的组成成分的细胞外基质)中的EDB结合后，能够激活T细胞。2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是scFv、单链抗体、纳米抗体(例如，VHH(驼科动物Ig)的衍生物)、单域抗体(dAb，VH或VL结构域的衍生物)、双特异性T细胞接合物(BiTE，一种双特异性的双链抗体)和双亲和力再靶定蛋白(DART，一种双特异性的双链抗体))；抗运载蛋白(脂蛋白的衍生物)；Adnectin(第10个FN3(纤连蛋白))；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)；或者亲和性多聚体(avimer)。3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是人scFv或人源化scFv。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的CAR，其进一步包含：在抗原结合结构域和TM结构域之间的铰链/间隔结构域。5.根据权利要求4所述的CAR，其中所述铰链/间隔结构域和TM结构域源自相同的蛋白质。6.根据权利要求5所述的CAR，其中所述相同的蛋白质是CD8α，并且其中所述铰链/间隔区是CD8α的胞外结构域。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的CAR，其中，(3)包括所述共刺激域。8.根据权利要求7所述的CAR，其中所述共刺激域来自CD28。9.根据权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中，(3)包括两个共刺激域。10.根据权利要求9所述的CAR，其中，所述两个共刺激域包括：来自CD28的一个共刺激域，和/或来自CD27、4
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1BB或OX
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40的一个共刺激域。11.根据权利要求1所述的CAR，其包含SEQ ID NO：1的残基21
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236的scFv，以及CD8α胞外结构域和跨膜结构域、4
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1BB胞内结构域和CD3zeta胞内结构域。12.根据权利要求11所述的CAR，其进一步包含N端信号肽序列(例如hIL
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2信号肽序列，或SEQ ID NO：1的残基1
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20)。13.根据权利要求12所述的CAR，其包含SEQ ID NO：1的多肽。14.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1
‑
13中任一项所述的CAR，例如SEQ ID NO：2的多核苷酸。15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其经密码子优化以在人细胞中表达。16.一种包含根据权利要求14或15所述的多核苷酸的载体。17.根据权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体为病毒载体，其能够在T细胞、巨噬细胞和/或NK细胞，例如原代人T细胞、巨噬细胞或NK细胞中感染和/或表达所述CAR。18.根据权利要求17所述的载体，其是慢病毒载体。19.根据权利要求18所述的载体，其中所述慢病毒载体是自失活的慢病毒载体。
20.一种表达根据权利要求1
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13中任一项所述的CAR的细胞，其包含根据权利要求14或15所述的多核苷酸或根据权利要求16
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19中任一项所述的载体。21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。22.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。23.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。24.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是巨噬细胞。25.根据权利要求20至24中任一项所述的细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨美家，张志杰，廖诗颖，缪应花，尹鸿萍，
申请(专利权)人：江苏艾洛特医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：