新型嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞制造技术

本发明专利技术为新型嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞，涉及一种能特异性结合肿瘤特异性标识的融合蛋白和能表达该融合蛋白的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。本发明专利技术的融合蛋白可以包含嵌合抗原受体(CAR)、白介素12(IL12)和氧依赖性降解区域(ODD)。本发明专利技术的CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述的胞外结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和胞内结构域激活T或NK细胞。本发明专利技术提供的CAR

【技术实现步骤摘要】
新型嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及新型嵌合抗原受体、包含其的免疫细胞及其制备和应用。

技术介绍

[0002]弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是恶性淋巴瘤中最常见的一种类型，约占其发病率的30％
‑
40％。DLBCL对传统化疗、放疗的反应均较好，单克隆CD20抗体利妥昔的加入进一步改善了疗效和预后，使半数以上的患者获得长期生存或治愈。现阶段，治疗的挑战是早期复发的难治患者，他们的生存期短，尚没有有效的治疗方法。亟待寻找有效的针对难治性DLBCL 的治疗方法和手段。
[0003]CAR
‑
T全称是Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell，基于嵌合抗原受体T细胞的免疫疗法是目前研究的热点。CAR
‑
T治疗基于将肿瘤患者自身免疫T细胞进行分离培养，利用转基因技术将包含特异识别肿瘤细胞表面抗原的分子，例如特异性单链抗体scFv(single chain antibody fragment)与T细胞共刺激分子的多顺反子蛋白表达于T细胞表面，将经基因改造后的T细胞回输入患者体内，回输后的CAR
‑
T细胞在体内特异性的识别并杀伤肿瘤细胞。
[0004]2011年，Carl H June教授发表了一例基于4
‑
1BB共刺激信号、靶向CD19的二代CAR
‑
T治疗案例，适应症为慢性粒细胞性白血病(CLL)，并成功治愈身患 CLL的4岁女孩Emily。随后CD19 CAR
‑
T被应用于ALL、CLL、DLBCL等多种血液疾病，其中大部分血液病ALL、CLL缓解率均可达到90％。
[0005]相对其他血液病高达90％的缓解率而言，CD19 CAR
‑
T对难治性DLBCL的治愈率不超过50％，究其原因，DLBCL的免疫微环境在一定程度上限制了CD19 CAR
‑
T 的疗效，因此迫切的需要寻找合适的能局部改善DLBLC肿瘤免疫微环境的方法。
[0006]白介素12(Interleukin
‑
12,IL
‑
12)，最早发现于EBV转化的B细胞中的一种由p35和p40亚基共价连接的异源二聚体复合物。IL
‑
12是具有多种功能的细胞因子，Hsieh et al在1993年发现，原始幼稚CD4
+
细胞在固有免疫细胞naturalkiller cell(NK)释放的interferon
‑
γ(IFN
‑
γ)的刺激下诱导表达转录因子STAT1，随后STAT1转录T
‑
bet的表达，T
‑
bet的表达促使幼稚CD4+细胞转化为 CD4
+
TH1效应细胞，同时T
‑
bet的表达诱发interleukin
‑
12receptorβ2
‑
subunit (IL
‑
12Rβ2)表达于CD4
+
Th1细胞膜表面，此时IL
‑
12结合于CD4+Th1细胞膜表面的IL
‑
12R，促使CD4
+
Th1细胞自分泌IFN
‑
γ并和其他炎症因子一起执行效应细胞功能，因此IL
‑
12在固有免疫和适应性细胞免疫中起到了桥梁的连接作用。IL
‑
12 的免疫调节功能并不仅限于固有免疫和适应性免疫的桥梁连接作用，IL
‑
12在促使CD4
+
TH1细胞自分泌IFN
‑
γ的同时，还可以诱导其他二级和三级促炎症细胞因子的释放，这些促炎症因子的释放对肿瘤细胞同样起到了细胞毒作用，而这些促炎症因子的释放也改变了肿瘤的局部免疫环境，在一定程度上延长了CD8
+
T细胞的存活，促进了肿瘤杀伤效果。综合从免疫细胞角度来看，IL
‑
12有助于促进 NK、NK
‑
Tcells、CD4
+
、CD8
+
T细胞增加其存活率和
增强细胞效应功能，特别是其诱导分泌的IFN
‑
γ，也起到了抗肿瘤的作用。从肿瘤微环境角度来看，IFN
‑
γ的分泌可减伤肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF),从而抑制肿瘤的转移。同时经过IL
‑
12刺激的NK、NK
‑
Tcells、CD4
+
、 CD8
+
T细胞可产生趋化因子IP
‑
10和MIG，IP
‑
10和MIG抑制内皮细胞基质金属蛋白酶(MMP)的表达，减少细胞外基质(ECM)重塑的改变，从而达到减少血管生成和肿瘤侵袭的效果。

技术实现思路

[0007]本专利技术的专利技术人发现，将CD19 CAR
‑
T与IL
‑
12连用联合治疗DLBCL，能够提高CD19 CAR
‑
T对DLBCL的缓解率。与此同时，IL
‑
12在带来免疫杀伤作用的同时，也带来了一定的细胞毒，尤其是对肝脏的细胞毒损伤，也使得IL
‑
12的抗肿瘤临床应用受到了极大的限制，因此也迫切的需要找到降低IL
‑
12肝毒性的解决办法。
[0008]为了克服IL
‑
12和CAR细胞联合使用时的毒负作用，本专利技术将融合蛋白 (IL
‑
12ODD)与CAR共表达于免疫细胞表面。肿瘤细胞的无氧糖酵解特性使得其能更加适应肿瘤局部的厌氧微环境。本专利技术设计的CAR或CAR免疫细胞使得氧压调控表达的分泌性IL
‑
12(IL
‑
12ODD)只能在肿瘤局部厌氧微环境下分泌发挥作用，而在正常组织的有氧环境中氧压调控ODD会启动泛素化降解途径使得IL
‑
12 降解，IL
‑
12ODD的应用使得IL
‑
12只有在肿瘤厌氧微环境中高表达发挥抗肿瘤作用，进而减少了在外周血正常组织中IL
‑
12的浓度及其所导致的肝及肺毒性。
[0009]另外，本专利技术发现，基于单链抗体scFv连接抗体重链可变区和轻链可变区的15～20个氨基酸的连接短肽(linker)能提高CAR免疫细胞和IL12联用的治疗效果。具体地，本专利技术应用了一种新型连接肽Linker218，与传统连接肽(G4S)3相比，Linker218能使单链抗体scFv呈现出更加柔性的空间结构而不会减低亲和力，并增加了对蛋白水解酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含(1)胞外抗原结合域；(2)跨膜域；和(3)胞内信号传导域，其特征在于，所述CAR还包含与所述胞内结构域连接并共表达的白介素12(IL12)与氧依赖性降解区域(ODD)的融合蛋白，任选地，所述胞内结构域与所述融合蛋白通过自剪切蛋白(例如选自由T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合组成的组)连接。2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜域来源于选自由T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和ICOS组成的组中的一种或多种的跨膜结构域。3.根据权利要求1所述的CAR，所述胞内信号转导域包含共刺激信号传导域且来自：CD2、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD7、CD22、CD27、CD28、CD30、CD40、CD66d、CD79a、CD79b、CD83、CD134、CD137、ICOS、CD154、4
‑
1BB和OX40、LFA
‑
1、LIGHT、NKG2C和B7
‑
H3中的一种或多种。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的CAR，还包含位于所述胞外抗原结合域的C
‑
末端和所述跨膜域的N
‑
末端之间的铰链域。5.如权利要求4所述的CAR，其中所述铰链域来源于CD8α。6.如权利要求1所述的CAR，其中胞外抗原结合域是能结合肿瘤细胞表面抗原(例如CD19，CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD44、CD138、CD276、EGFR、BCMA，HER1、HER2、HER3、EpCAM、间皮素(mesothelin)、FAP(Fibroblast activation protein)、Glypican
‑
3、CEA、PSMA、IL13Rα2、CD171、GD2、CEACAM6、CLDN4、CLDN18.2、NKGD2、LAMC2、CA9、CST1、EPPK1和ANO1中的一种或多种)的分子，例如抗体(Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab
’
片段、F(ab)
’2片段、F(ab)
’3片段、Fv、scFv、双
‑
scFv、(scFv)2、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、二硫键稳定的Fv蛋白以及单结构域抗体(sdAb，纳米抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王尧河，周文平，苗晋鑫，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：