一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程领域，公开了一种奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽：包括奶牛气管抗菌肽、奶牛β

【技术实现步骤摘要】
一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，更具体地说，本专利技术涉及一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其创新应用。

技术介绍

[0002]奶牛气管抗菌肽(TAP)是牛气管黏膜上皮细胞分泌的具有广谱抗菌活性的多肽。病原微生物和多种促炎因子均能特异性诱导TAP基因在奶牛乳腺组织表达上调，最大上调数十倍，增强了乳腺组织的防御能力。牛气管黏膜抗菌肽是由美国科学家Diamond等从牛气管黏膜上皮细胞中分离得到的一种阳离子型的抗菌活性小肽，体外实验表明TAP具有广谱抗菌活性，对细菌与真菌均具有抑制作用。湿重为1g的牛气管黏膜上皮中可以提取到2μg的牛气管抗菌肽。在抗菌肽家族中，TAP属于β
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干扰素家族，是一组具有独特氨基酸序列的抗菌肽，有3个分子内二硫键，其中6个Cys残基在肽链上所处位置与干扰素家族不同，且N端有一个不同于干扰素的5
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羟脯氨基。研究表明，牛气管抗菌肽具有抗G
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菌和G
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菌及真菌的活性，对G
+
菌的杀伤作用大于对G
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菌的杀伤作用，对于哺乳动物没有不良影响。
[0003]奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升，大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳房炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，由于牛气管抗菌肽是生物体内天然的抗菌物质，对动物机体无毒无害，因此有望成为新型抗生素的替代品。
[0004]目前气管抗菌肽主要应用在抗菌药物和抗肿瘤药物制备领域，在食品工程及新型药物领域应用尚有待进一步开发。气管抗菌肽是高等动物编码的蛋白，在大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌里面表达有可能会有活性低、无法正确折叠以及形成不溶性包涵体等问题，因此现有抗菌肽的制备多采用真核表达系统——毕赤氏酵母。但是使用毕赤氏酵母制备抗菌肽前需要对目的蛋白进行密码子序列优化，在这个过程中很可能影响原本序列较短的抗菌肽，与此同时抗菌肽在毕赤氏酵母中表达后，最终产物与正常抗菌肽比较，会带上4个多余的氨基酸Glu、Ala、Glu和Ala，并与抗菌肽本身N
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端尾巴形成离子键，妨碍其功能的发挥，并且使蛋白容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低抗菌肽的活性。除此之外，奶牛乳腺生物反应器也被应用在抗菌肽的制备当中，然而相比于真核表达系统——毕赤氏酵母其制备成本较高。综上所述，进一步开发气管抗菌肽的应用领域，以及构建更高效的抗菌肽制备系统，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽，其可同时满足兽药制备、医药开发、食品保鲜等多个领域的应用需求，所述抗菌多肽
的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本专利技术还提供上述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛气管抗菌肽基因的5
’
端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3
’
端插入β
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乳球蛋白肽基因，插入β
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乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]进一步的，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将奶牛气管抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中。
[0009]进一步的，所述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织，冲洗后剥离脂肪组织和结缔组织，分离腺泡组织并传代培养，加入胰酶消化液得到单细胞悬液，分离原代奶牛乳腺上皮细胞，作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。
[0010]进一步的，分离腺泡组织将其接种至培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中20
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30分钟左右，使组织块微干涸，然后向培养皿中轻轻加入约1mL培养液，置CO2培养箱中培养1
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2小时后再补1mL培养基，在培养箱内静置培养两天，第三天更换培养液，以后每两到三天更换一次培养液。
[0011]进一步的，加入胰酶消化液后，至于培养箱内37℃消化3
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5分钟，倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆后立即将消化液吸出，继续在培养箱内孵育3
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5min，让残留的消化液将细胞消化并脱离瓶底或皿底，立即加2mL含10％FBS的培养液终止消化，用移液器吸取瓶内培养液，反复吹打瓶底细胞，使其成为单细胞悬液。本专利技术还有一个目的是提供一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在抗菌肽制备中的应用，具体的方法为：采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在抗菌肽基因5
’
端插入牛乳蛋白表达启动元件，插入β
‑
乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本专利技术还有一个目的是提供一种抗菌多的应用，所述抗菌多肽应用于养殖业，具有多方面优益效果，一方面应用在兽药领域可作为防治奶牛乳腺炎的重要材料，另一方面作为饲料防腐剂在奶牛饲料中添加。用于食品保鲜，不仅具有高效的抑菌性能而且对可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状。
[0013]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种抗菌多肽，其中，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在抗菌肽制备中的应用。
[0015]优选的是，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在抗菌肽基因5
’
端插入牛乳蛋白表达启动元件，插入β
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乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示，所述的抗菌肽基因表达量可上调23202倍，抗菌肽可顺利分泌至原代乳腺上皮细胞外，且所制备的抗菌肽活性相比于传统毕赤氏酵母作为生物反应器可以显著提高。
[0016]本专利技术还提供上述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在制备奶牛乳腺炎药物中的应用。本专利技术还提供一种抗菌多肽在奶牛乳腺炎防控中的应用。
[0017]优选的是，给药方式即可通过静脉注射制备抗菌多肽的重组质粒组合物，也可直接乳房基部穿刺注射抗菌多肽。其中，所重组质粒复合物至少包含制备抗菌多肽的重组质粒、F
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PEI(1mg/mL)(二者质量比为1:1)，使用1
×
PBS缓冲液将重组质粒复合物稀释至500μ
g/mL。
[0018]本专利技术还提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽，其特征在于，所述奶牛抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛气管抗菌肽基因的5
’
端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3
’
端插入β
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乳球蛋白肽基因，插入β
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乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将奶牛气管抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中。4.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，所述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织，冲洗后剥离脂肪组织和结缔组织，分离腺泡组织并传代培养，加入胰酶消化液得到单细胞悬液，分离原代奶牛乳腺上皮细胞，作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。5.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，分离腺泡组织将其接种至培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨章平，张志鹏，杨奕，陈代杰，陈志，徐天乐，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：