ROR1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用制造技术

本发明专利技术涉及ROR1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用。所述CAR包括信号肽、ROR1抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号结构域，上述CAR修饰的免疫细胞适合用于治疗恶性肿瘤，如癌症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ROR1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用


[0001]本专利技术涉及生物医学或生物制药
，具体涉及一种ROR1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用。

技术介绍

[0002]近年一种称为过继细胞转移(adoptive cell transfer,ACT)的新兴免疫疗法快速发展，该疗法利用免疫细胞来消灭癌症，其中一些方法涉及获取天然免疫细胞并直接扩大其数量，而其他方法涉及对免疫细胞进行基因工程以增强其抗癌能力。
[0003]就癌症而言，被称为杀伤性T细胞的免疫细胞由于能够与癌细胞表面的标记物(即抗原)结合，对癌症治疗特别有效，细胞免疫疗法即以不同方式利用这种天然能力，包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor
‑
infiltrating lymphocyte,TIL)疗法、工程T细胞受体(engineered T cell receptor,TCR)疗法、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法、自然杀手(NK)细胞疗法等。尽管有多种类型的ACT疗法，迄今为止在临床开发中进展最大的是CAR
‑
T细胞疗法。
[0004]越来越多的CAR
‑
T细胞疗法被开发以应用于临床研究，尽管这些疗法之间存在很多差异，但它们都有相似的组成部分。细胞表面的CAR由合成抗体的片段或结构域组成，该结构域会影响受体识别或结合肿瘤细胞抗原的能力；受体依赖来自细胞内部的刺激信号完成其工作，因此，每个CAR
‑
T细胞都有细胞内信号结构域和“共刺激”结构域，从表面受体向细胞发出信号，使用不同结构域会影响细胞的整体功能。随着CAR
‑
T细胞胞内工程改造技术的进步，T细胞在患者体内的扩增能力和存活时间逐步提高。
[0005]ROR1是孤儿受体家族成员之一，在物种间高度保守，参与控制细胞生长和上皮间质转化等多种信号通路(Shabani M,Naseri J,Shokri F.Receptor tyrosine kinase
‑
like orphan receptor 1:a novel target for cancer immunotherapy.Expert Opin Ther Targets.2015Jul；19(7):941
‑
55)。Wnt5a是ROR1的配体之一(Fukuda T,Chen L,Endo T,Tang L,Lu D,Castro JE,et al.,Antisera induced by infusions of autologous Ad
‑
CD154
‑
leukemia B cells identify ROR1 as an oncofetal antigen and receptor for Wnt5a.Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(8):3047
–
52)。
[0006]ROR1被认为是多种恶性肿瘤的生存影响因子，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤(Hojjat
‑
Farsangi M,Moshfegh A,Daneshmanesh AH,Khan AS,Mikaelsson E,Osterborg A,et al.,The receptor tyrosine kinase ROR1—an oncofetal antigen for targeted cancer therapy.Semin Cancer Biol.2014；29:21
–
31)。
[0007]ROR1的氨基末端是一个细胞外免疫球蛋白样结构域、一个富含半胱氨酸的结构域，也称为卷曲(Frizzled)结构域，以及一个高度折叠并且富含半胱氨酸的克林格(Kringle)跨膜结构域。ROR1的细胞内部分包含一个激酶活性存在争议的酪氨酸激酶结构域、一个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域、一个富含脯氨酸的结构域，以及另一个位于羧基末
端的富含丝氨酸/苏氨酸的结构域，其可能参与蛋白质相互作用(Shabani M.,Naseri J,Shokri F.Receptor tyrosine kinase
‑
like orphan receptor 1:a novel target for cancer immunotherapy.Expert Opin Ther Targets.2015Jul；19(7):941
‑
55)。WNT5A是ROR1已知唯一的配体，通过卷曲结构域与ROR1结合。克林格结构域负责与CLL细胞中另一个ROR家族蛋白ROR2异二聚化，这导致Rho家族的小G蛋白(small GTPase)激活，癌细胞随之增殖和迁移。
[0008]ROR1在中枢神经系统、心脏、骨骼肌和肺脏系统的胚胎发育过程中高度表达，除了脂肪组织、少量的早期B细胞亚群和上消化道细胞外，成人的正常组织不表达ROR1(Balakrishnan et al.,Analysis of ROR1 protein expression in human cancer and normal tissues.Clin Cancer Res.2016.Epub 2016/11/18)。
[0009]ROR1通过PI3K/AKT/mTOR通路和EGFR介导的信号传导在肿瘤的发生中发挥重要作用。
[0010]靶向ROR1治疗癌症的一个重要方法就是过继转移靶向ROR1的CAR
‑
T细胞，CAR
‑
T细胞是表达CAR的工程化T细胞，该CAR由结合结构域或对肿瘤抗原(如ROR1)具有特异性的单链抗体组成，制备的ROR1特异性CAR在体外和体内均显示出对表达ROR1的肿瘤细胞的有效识别，这些ROR1特异性CAR
‑
T细胞的过继转移已被证明可以安全有效地清除灵长类动物的ROR1
+
B细胞，但目前针对ROR1的CAR
‑
T效果仍然不尽如人意。
[0011]双阴性T细胞(DNT细胞)是表达CD3
‑
TCR复合物但不表达CD4、CD8或NKT细胞标志物αGalCer
‑
CD1d和Jα24
‑
Vα14的成熟外周T淋巴细胞，在人类外周血单核细胞(PBMC)中占比1
‑
5％(zhang et al.,2000)。这种治疗方法可以将系统或局部接种致死剂量A20淋巴瘤细胞(Young et al.,2001；Young et al.,2003)的死亡率降低75％以上。此外，从化疗完全缓解期间AML患者提取扩增DNT细胞的方案已被公开，并且已经证实AML患者来源的DNT细胞对自体原代AML细胞具有显着的抑制活性(Young et al.,2003)。与CD4或CD8 T细胞不同，输入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合抗原受体，包括：(1)胞外结构域，包含至少一个特异性结合ROR1的抗原结合结构域或scFv；(2)铰链区；(3)跨膜区；(4)胞内信号域；其中，抗原结合结构域包含具有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及具有LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区；其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的多肽序列选自：a.SEQ ID NOs：2、3、4、6、7、8；或b.SEQ ID NOs：16、17、18、20、21、22；或c.SEQ ID NOs：30、31、32、34、35、36；或者，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的多肽序列选自：a.SEQ ID NOs：9、10、11、12、13的第1
‑
2位氨基酸(DA)、14；或b.SEQ ID NOs：23、24、25、26、27的第1
‑
2位氨基酸(DA)、28；或c.SEQ ID NOs：37、38、39、40、41的第1
‑
2位氨基酸(DA)、42。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域包括：(1)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区；或(2)具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：19的多肽序列的轻链可变区；或(3)具有SEQ ID NO:29的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:33的多肽序列的轻链可变区。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中scFv由式A或式B表示：V
H
‑
V
L
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(A)；V
L
‑
V
H
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(B)；其中，V
H
为抗体重链可变区，V
L
为抗体轻链可变区，
“‑”
是连接肽或肽键。4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中连接肽是(GGGGS)n，其中n为1、2、3或4。5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中嵌合抗原受体的结构如式I所示：L
‑
scFv
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
ꢀꢀꢀꢀ
(I)其中，L代表无或信号肽序列；scFv代表ROR1抗原结合结构域；H代表无或铰链；TM代表跨膜结构域；C代表共刺激信号结构域；CD3ζ代表源自CD3ζ的细胞内信号序列；每个
“‑”
代表独立的连接肽或肽键。6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中L是选自CD8、CD28、GM
‑
CSF、CD4、CD137及其组合的信号肽。
7.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中L是源自CD8的信号肽。8.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中H是选自CD8、CD28、CD137及其组合的铰链区。9.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中H是源自CD8的铰链区。10.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中TM是选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其组合的跨膜区。11.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中TM是源自CD8或CD28的跨膜区。12.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中C是选自OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4
‑
1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM
‑
1、LFA
‑
1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2及其组合的共刺激信号结构域。13...

【专利技术属性】
技术研发人员：范国煌，王建飞，
申请(专利权)人：南京艾美斐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：