一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用。该蛋白的编码序列如SEQIDNO.1所示，用于制备重组Fiber2蛋白，步骤为：通过密码子优化合成Fiber2基因，在Fiber2的N端融合杜氏藻碳酸酐酶N

【技术实现步骤摘要】
一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于重组基因蛋白药物
，具体涉及一种重组Fiber2蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒血清4型(FAdV
‑
4)是引发心包积液综合征(HIS)的病原。该病是家禽养殖业的主要传染病之一，以心包积液和包涵体肝炎为特征。FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染会引发肌胃糜烂、心包积液及包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染等，给养鸡业造成较大损失。禽腺病毒感染事件，于1963年首次在美国发生，随后扩散至世界各地。发病鸡除3～4周龄的肉鸡外，10
‑
20周龄的蛋鸡也可被FAdV感染。目前高致病性血清4型FAdV在鸡群中流行最广泛，致病性也最强，给养鸡业造成了最为严重的经济损失。
[0003]禽腺病毒是一种没有包膜的直径为70
‑
90nm的颗粒，呈二十面体结构。FAdV的结构蛋白主要有：六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和位于五邻体上的纤维突起(Fiber)三种蛋白。每个五邻体上有2个纤突蛋白，其中，FAdV
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A和FAdV
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C由2个不同的纤突蛋白基因编码，分别称为Fiber
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1和Fiber
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2；FAdV
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B，FAdV
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D和FAdV
‑
E的2个纤突蛋白只有一个纤突蛋白编码基因。纤突蛋白带有亚群特异性和型特异性抗原表位。
[0004]由于高致病性血清4型FAdV对养鸡业造成的巨大危害，许多研究者致力于开发能保护鸡群免于感染FAdV
‑
4的疫苗。其中亚单位疫苗没有全病毒灭活疫苗可能造成感染扩散流行的风险，是所有疫苗中最安全的疫苗种类，同时生产成本较低，是疫苗研究的最佳方向。研究表明FAdV
‑
4的纤突蛋白Fiber2可作为制备亚单位疫苗的抗原蛋白，然而，目前Fiber2蛋白的制备方法存在一些缺陷，未经改造的Fiber2蛋白用原核细胞表达为无生物活性的包涵体，很难将其直接制成疫苗，且产品品质不可控，免疫原性相对较差，使用后仍存在感染风险；通过Sumo融合表达的Fiber2蛋白在原核系统中可溶性表达，但极其不稳定，在纯化过程中蛋白容易降解，且Sumo标签需要通过昂贵的蛋白酶酶切去除，纯化工艺相对复杂导致Fiber2蛋白的产率很低，工业化生产成本高。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组Fiber2蛋白的编码序列，同时通过所述编码序列得到一种重组Fiber2蛋白，并进一步提供所述重组Fiber2蛋白的应用，其技术方案如下：
[0006]一种重组Fiber2蛋白，重组Fiber2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1中位于第1～7位的HIS标签氨基酸序列，位于第8～19位的杜氏藻碳酸酐酶N
‑
半结构域的前11个氨基酸残基序列，Fiber2蛋白的氨基酸序列位于SEQ ID.NO.1中的其他位置。
[0007]进一步的，编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]一种包含编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列的重组Fiber2蛋白表达载体。
[0009]一种包含所述重组Fiber2蛋白表达载体的宿主细胞。
[0010]一种重组Fiber2蛋白的制备方法，通过将编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到所述重组Fiber2蛋白。
[0011]进一步的，所述重组Fiber2表达载体为pET23a
‑
rFiber2，其制备方法如下：
[0012](1)第一PCR扩增：根据GeneBank：MN577985.1公布的Fiber2基因序列，进行密码子优化设计引入VSEPHDYNYEK末端同源序列，合成重组Fiber2基因作为模板，以如SEQ ID NO:3所示的F1和如SEQ ID NO:4所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到重组Fiber2线性片段；
[0013](2)第二PCR扩增：以pET23a质粒为模板，以如SEQ ID NO:5所示的F2和如SEQ ID NO:6所示的R2为引物，进行载体PCR扩增，获得pET23a载体的线性片段；
[0014](3)将所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增获得的重组rFbier2、pET23a载体的两个线性片段按摩尔比3：1用T5核酸外切酶进行冰水浴消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR鉴定筛选，得到pET23a
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rFiber2表达载体。
[0015]进一步的，所述表达步骤为：将所述重组载体pET23a
‑
rFiber2转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到表达菌株，将所述表达菌株接种于含氨苄霉素的液体LB培养基中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1
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1mM，18
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37℃诱导表达4
‑
20h。
[0016]进一步的，所述纯化及内毒素去除步骤为：用含0.1％Triton X114的裂解缓冲液重悬诱导后的菌体，超声破菌，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤；Ni
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NTA填料装柱，使用5倍柱体积纯水冲洗柱子除去乙醇；用5倍柱体积0.1％Triton X114的裂解缓冲液平衡柱子；过滤后的上清蛋白过柱；用5倍柱体积含0.1％Triton X114的60mM咪唑洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白及内毒素；用5倍柱体积缓冲液B洗涤柱子除去残余的Triton X114；用3倍柱体积500mM咪唑洗脱液洗脱重组Fiber2蛋白。
[0017]一种重组Fiber2蛋白在制备预防药物中的应用。
[0018]本专利技术提供的技术方案至少包括以下有益效果：
[0019]1、本专利技术通过在Fiber2的N端融合杜氏藻碳酸酐酶N
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半结构域的前11个氨基酸残基(VSEPHDYNYEK)和His6，这种表达结构提高了重组Fiber2蛋白在大肠杆菌中的表达量和可溶性，可用于大规模发酵生产。
[0020]2、由于重组Fiber2蛋白的N端含有6个His，使得表达的重组Fiber2蛋白可以通过Ni
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NTA一步亲和纯化；同时11个氨基酸残基(VSEPHDYNYEK)还充当Linker使His标签充分暴露，提高了重组Fiber2蛋白与Ni
‑
NTA的结合效率，提高了蛋白的纯化得率。
[0021]3、Ni
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NTA亲和层析纯化过程中，在裂解缓冲液和洗涤缓冲液中添加了0.1％的Triton X114，该方法将杂蛋白的去除和内毒素的去除同步进行，简化了蛋白的纯化工艺。
[0022]4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组Fiber2蛋白，其特征在于，所述重组Fiber2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1中位于第1～7位的HIS标签氨基酸序列，位于第8～19位的杜氏藻碳酸酐酶N
‑
半结构域的前11个氨基酸残基序列，Fiber2蛋白的氨基酸序列位于SEQ ID.NO.1中的其他位置。2.根据权利要求1所述重组Fiber2蛋白，其特征在于，其编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种包含如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的重组Fiber2蛋白表达载体。4.一种包含如权利要求3所述重组Fiber2表达载体的宿主细胞。5.一种如权利要求1
‑
2所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，通过将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列克隆到pET23a表达载体上，得到重组Fiber2蛋白表达载体；将所述重组Fiber2表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，分离纯化，得到所述重组Fiber2蛋白。6.根据权利要求5所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组Fiber2表达载体为pET23a
‑
rFiber2，其制备方法如下：(1)第一PCR扩增：根据Gene Bank:MN577985.1公布的Fiber2基因序列，进行密码子优化设计引入VSEPHDYNYEK末端同源序列，合成重组Fiber2基因作为模板，以如SEQ ID NO:3所示的F1和如SEQ ID NO:4所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到重组Fiber2线性片段；(2)第二PCR扩增：以pET23a质粒为模板，以如SEQ ID NO:5所示的F2和如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，王斌，周明光，孙婉莹，张丽华，邵伟，金建云，陈章表，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：