一种可诱导嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可诱导嵌合抗原受体及其应用，涉及免疫治疗技术领域。本发明专利技术提供了一种可诱导嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：抗人CSF1R的单链抗体scFv、截短的hIgG1铰链区SH、T细胞共刺激信号分子以及T细胞胞内信号结构域；所述嵌合抗原受体的转录由可诱导表达元件tet operater调控。所述经诱导表达的嵌合抗原受体分子可用于修饰T淋巴细胞，消除了CAR

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫治疗
，具体涉及一种可诱导嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]全球老龄化社会导致阿尔兹海默病(AD)等老年期痴呆在2016年已超过5000万，直接医疗费用及间接照料支出巨大。而AD已有药物只能对症缓解，并不能延缓病程，近16年来3000多种药物均告失败。提示仅从AD的病理学特征
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β淀粉样蛋白和过磷酸化tau进行“头痛医头”式单一靶点治疗很难成功，而应从慢性炎症等促进疾病进展等病理机制进行多靶点干预治疗新策略探索。美国FDA宣布AD新药研发的重大变化：与既往新药研发集中在出现明显认知障碍的3期和4期阶段相比，将支持极早期(1期：出现AD病理变化，但没有任何临床症状；2期：病理变化基础上出现微小且可测的神经生理学异常，也没有出现功能上的衰退)的疾病干预，明确提出采用生物标志物作为新的临床终点。
[0003]嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptormodified T cells，CAR
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T)是由抗原特异性的受体或特异性识别抗原的单克隆抗体的scFv、胞外间隔序列、细胞跨膜区和胞内T细胞活化结构域串联而成。作为特异性细胞免疫疗法之一，CAR
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T细胞在肿瘤领域进展日新月异。M1型小胶质细胞因子是引发神经系统炎症的主要细胞，对AD的发生发展具有明确的促进作用，CSF1R在M1型小胶质细胞表面高表达，是理想的靶向治疗靶点。因此，靶向CSF1R的CAR/>‑
T细胞治疗AD在理论上可行。然而，由于CAR
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T细胞具有非常强的靶向杀伤作用，可以在短时间快速杀伤大量靶细胞后，释放大量的细胞因子，从而诱发“细胞因子风暴”(cytokine storm，CRS)。因此，控制CSR的副作用在临床治疗中尤其重要。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种嵌合抗原受体，通过利用可诱导表达系统，实现对CAR基因表达水平进行调控，避免了CAR
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T细胞发挥治疗作用时可能触发的“细胞因子风暴”副作用。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：抗人CSF1R的单链抗体scFv、截短的hIgG1铰链区SH、T细胞共刺激信号分子以及T细胞胞内信号结构域；所述嵌合抗原受体的转录由可诱导表达元件调控，所述可诱导表达元件为tet operater。
[0007]优选的，所述tetoperater的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0008]优选的，所述截短的hIgG1铰链区SH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]优选的，所述T细胞共刺激信号分子包括CD28、41BB、OX40中的一种或多种。
[0010]优选的，所述T细胞胞内信号结构域为CD3 Zeta胞内信号活化结构域。
[0011]优选的，所述嵌合抗原受体的氨基末端连接信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]优选的，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述嵌合抗原受体
的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒包含上述的嵌合抗原受体。
[0014]本专利技术还提供了一种CAR
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T细胞，所述CAR
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T细胞表达上述的嵌合抗原受体；或所述CAR
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T细胞包括上述的重组慢病毒。
[0015]本专利技术还提供了上述的嵌合抗原受体、重组慢病毒或CAR
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T细胞在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
[0016]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，可以利用病毒载体制备得到包含所述嵌合抗原受体的慢病毒假型病毒颗粒，利用制备的慢病毒转导活化T细胞，制备成可诱导的CAR
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T细胞。本专利技术嵌合抗原受体表达时间与表达水平通过诱导剂DOX添加时间和剂量进行调控，在DOX诱导剂存在情况下，CAR
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T细胞特异性杀伤CSF1R阳性的靶细胞，分泌细胞因子IL
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2和IFN
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γ；在撤掉诱导剂DOX后，CAR
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T细胞几乎对CSF1R阳性细胞不产生杀伤作用，不再分泌细胞因子IL
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2和IFN
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γ。经实验证实，采用本专利技术的CAR
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T细胞能调控性杀伤靶细胞，提高了对AD治疗的靶向性；同时，本专利技术通过利用可诱导表达系统，实现了对CAR基因表达水平的调控，能够控制细胞因子分泌水平，有效避免了CAR
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T细胞发挥治疗作用可能触发的“细胞因子风暴”副作用。
附图说明
[0017]图1为本专利技术所述的合成CSR1 CAR基因利用PCR扩增后DNA片段。
[0018]图2为本专利技术所述的载体质粒DNA双酶切。
[0019]图3为本专利技术所述的合成CAR基因亚克隆到慢病毒可诱导载体pLVX
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TetOn上菌落PCR验证结果。
[0020]图4为本专利技术所述的合成CAR基因亚克隆到慢病毒可诱导载体pLVX
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TetOn上酶切验证结果。
[0021]图5为加DOX诱导够48h，利用流式细胞术检测CSF1 CAR慢病毒转导在T细胞中的表达。
[0022]图6为加DOX诱导够48h，利用qPCR检测CSF1 CAR mRNA表达水平。
[0023]图7为FACS检测A549
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CSF1R
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GFP稳转细胞株的CSF1R表达率。
[0024]图8为MTS检测本专利技术中CSF1 CAR
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T细胞在DOX诱导前后对靶细胞后A549
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CSF1R杀伤作用。
[0025]图9为本专利技术中可诱导CSF1R.CAR
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T杀伤靶细胞后IL
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2表达。
[0026]图10为本专利技术中可诱导CSF1R.CAR
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T杀伤靶细胞后IFN
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γ表达。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：抗人CSF1R的单链抗体scFv、截短的hIgG1铰链区SH、T细胞共刺激信号分子以及T细胞胞内信号结构域；所述嵌合抗原受体的转录由可诱导表达元件调控，所述可诱导表达元件为tet operater。
[0028]本专利技术中，所述tet operater含tTA结合原件，所述tet operater的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。本专利技术所述tetoperater可诱导调控CAR的表达。本专利技术中，所述抗人CSF1R的单链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：抗人CSF1R的单链抗体scFv、截短的hIgG1铰链区SH、T细胞共刺激信号分子以及T细胞胞内信号结构域；所述嵌合抗原受体的转录由可诱导表达元件调控，所述可诱导表达元件为tet operater。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述tet operater的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述截短的hIgG1铰链区SH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞共刺激信号分子包括CD28、41BB、OX40中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞胞内信号结构域为CD3 Zeta胞内信号活化结构域。6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端连接信号肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊，王艳丽，姜季委，杜忠礼，杜振兰，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京天坛医院，
类型：发明
国别省市：