一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明专利技术分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CNT，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.45116。利用该菌株分泌获得的苯酰菌胺单克隆抗体用于进行食品安全检测中苯酰菌胺残留的分析检测。本发明专利技术获得的苯酰菌胺单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测，其对苯酰菌胺有较好的检测灵敏度和特异性(IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，尤其是指一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]苯酰菌胺是一种苯甲酰胺类保护性杀菌剂，具有新颖的作用机理，在卵菌纲真菌剂中较独特，它通过微管蛋白
‑
亚基的结合和微管细胞骨架的破裂来抑制菌核分裂，不影响游动孢子的游动、包囊形成或萌发，伴随着菌核分裂的第一个循环，芽管的伸长受到抑制，从而阻止病菌穿透寄主植物。苯酰菌胺是抗有丝分裂类杀菌剂中唯一对卵菌有效的药剂，可有效防治包括葡萄和马铃薯在内的果树和蔬菜等作物上由卵菌纲真菌引起的病害，如马铃薯和番茄晚疫病、黄瓜霜霉病和葡萄霜霉病等，对葡萄霜霉病有特效，具有较长的持效期和很好的耐雨水冲刷性能，其新颖的作用机理，杀菌谱广、活性高，符合我国的农药发展方向具有广阔的应用前景和市场前景。目前，美国已经规定了其在蔬菜、水果等多种农产品中的残留限量，因此，研究建立苯酰菌胺的残留检测方法具有重要意义。
[0003]对于苯酰菌胺残留的检测，常采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法。但这些方法存在样品前处理复杂和检测时间长等不足，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对苯酰菌胺的高效、快速的检测方法。
[0004]酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在抗生素残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测苯酰菌胺的前提是得到对苯酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对苯酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的苯酰菌胺单克隆抗体对苯酰菌胺具有较好的特异性和检测灵敏度(IC
50
值为1.09ng/mL)，可以用于建立苯酰菌胺的免疫学检测方法，检测食品中苯酰菌胺的残留。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45116。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供所述的杂交瘤细胞株的制备方法，制备过程中使用的苯酰菌胺半抗原为ZOX
‑
COOH，其分子结构式：
[0008][0009]在本专利技术的一种实施例中，制备过程中使用的苯酰菌胺完全抗原为ZOX
‑
COOH
‑
BSA，其分子结构式：
[0010][0011]本专利技术还提供了所述分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，具体包含如下步骤：
[0012](1)使用苯酰菌胺半抗原制备苯酰菌胺完全抗原，将获得的苯酰菌胺完全抗原制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；
[0013](2)将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；
[0014](3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中苯酰菌胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；
[0015](4)将筛选出的小鼠用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的苯酰菌胺完全抗原进行；
[0016](5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行的。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。
[0025]在本专利技术的一种实施例中，所述苯酰菌胺完全抗原通过以下方法制备得到：将苯酰菌胺半抗原和N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于有机溶剂中反应，得到苯酰菌胺半抗原ZOX
‑
COOH溶液；同时，将1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于有机溶剂后，加入到苯酰菌胺半抗原ZOX
‑
COOH溶液中，混合反应得到A液；将牛血清蛋白BSA用缓冲溶液稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液，并用缓冲液透析反应液，得到所述苯酰菌胺完全抗原ZOX
‑
COOH
‑
BSA。
[0026]在本专利技术的一个实施例中，所述有机溶剂为DMF。
[0027]在本专利技术的一个实施例中，所述缓冲溶液为碳酸盐缓冲溶液；所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
[0028]本专利技术还提供了苯酰菌胺包被原的合成方法，具体：
[0029]将苯酰菌胺半抗原(ZOX
‑
COOH)、N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应，得到苯酰菌胺半抗原(ZOX
‑
COOH)溶液；将1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于有机溶剂后，加入到ZOX
‑
COOH溶液中，室温搅拌进行反应4
‑
6h，得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45116。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，制备过程中使用的苯酰菌胺半抗原为ZOX
‑
COOH，其分子结构式：3.权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，制备过程中使用的苯酰菌胺完全抗原为ZOX
‑
COOH
‑
BSA，其分子结构式：4.权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述苯酰菌胺完全抗原通过以下方法制备得到：将苯酰菌胺半抗原和N
‑
羟基琥珀酰亚胺NHS溶于有机溶剂中反应，得到苯酰菌胺半抗原ZOX
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COOH溶液；同时，将1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶于有机溶剂后，加入到苯酰菌胺半抗原ZOX
‑
COOH溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽强，程媛，胥传来，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，马伟，朱建平，郝昌龙，宋珊珊，胡拥明，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：