一株双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术合成了双草醚半抗原，制备双草醚完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂，多次加强免疫用弗氏不完全佐剂，最后一次用双草醚完全抗原冲刺免疫。取高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于食品安全免疫检测领域，尤其是指一株双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]双草醚是一种超高效、广谱、低毒的除草剂，它通过抑制植株所必需的氨基酸缬氨酸和异白氨的生物合成来阻止细胞分裂，从而使植株停止生长。主要用于防治水稻田稗草等禾本科杂草和阔叶杂草，但其在水稻中的残留对人类健康的危害和环境污染日益成为人们关注的焦点。日本、韩国规定双草醚在稻米中的最大残留限量为0.1mg/kg。因此，有必要建立快速、高效的食品中双草醚的检测方法。
[0003]双草醚含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC
‑
MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的双草醚检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为双草醚检测提供了一种新的检测途径。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的双草醚单克隆抗体对双草醚具有较好的特异性和检测灵敏度(IC
50
值为0.45ng/mL)，可以用于建立双草醚的免疫学检测方法，检测食品中双草醚的残留。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，所述交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45111。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供所述分泌双草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，具体包含如下步骤：
[0007](1)使用双草醚制备免疫原双草醚
‑
BSA，将获得的免疫原双草醚
‑
BSA制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；
[0008](2)将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；
[0009](3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中双草醚抗体含量高的获得免疫的小鼠；
[0010](4)将筛选出的小鼠用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的双草醚完全抗原进行；
[0011](5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛
选出获得能分泌双草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中，所述双草醚完全抗原通过以下方法制备得到：将双草醚溶于有机溶剂中，并加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行反应，得到A液；将牛血清蛋白BSA溶于碳酸盐缓冲液，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液，并用缓冲液透析反应液，得到双草醚完全抗原。
[0013]本专利技术的一个实施方式中，所述N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的质量比为1:1
‑
1:5。
[0014]在本专利技术的一个实施方式中，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05M
‑
0.2M。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，所述有机溶剂为DMF或者二甲亚砜，甲醇。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行的。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。
[0024]本专利技术的第三个目的是提供一种双草醚单克隆抗体，所述双草醚单克隆抗体由中所述杂交瘤细胞株分泌得到。
[0025]本专利技术的第四个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的双草醚单克隆抗体。
[0026]本专利技术的第五个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的双草醚单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。
[0027]本专利技术的第六个目的是提供一种试纸条，所述试纸条含有中所述杂交瘤细胞株、中所述的双草醚单克隆抗体和所述组合物中的一种或多种。
[0028]本专利技术的第七个目的是提供一种芯片，所述芯片含有中所述杂交瘤细胞株、所述的双草醚单克隆抗体和所述组合物中的一种或多种。
[0029]本专利技术的第八个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的双草醚单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒、所述的试纸条或所述的芯片在检测双草醚中的应用。
[0030]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0031]本专利技术提供的双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对双草醚具有较好的特异性和检测灵敏度(IC
50
值为0.45ng/mL)，为检测水稻和其他含有双草醚的食品中
双草醚含量提供了免疫学方法。本专利技术提供的双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测双草醚的试剂盒，具有实际应用价值。
[0032]生物材料样品保藏：一株分泌双草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株FLL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌双草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45111。2.权利要求1中所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用双草醚制备免疫原双草醚
‑
BSA，将获得的免疫原双草醚
‑
BSA制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；(2)将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中双草醚抗体含量高的获得免疫的小鼠；(4)将筛选出的小鼠用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的双草醚完全抗原进行；(5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌双草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述免疫原双草醚
‑
BSA的制备方法为：将双草醚...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，晁梦佳，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，马伟，朱建平，郝昌龙，宋珊珊，胡拥明，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：