猪瘟病毒2型E制造技术

本发明专利技术属于兽用生物制品领域，本发明专利技术公开了一株猪瘟病毒2型E

【技术实现步骤摘要】
猪瘟病毒2型E
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蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用


[0001]本专利技术涉及猪瘟病毒2型E
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蛋白特异性单克隆抗体细胞株的制备；基于该单抗建立阻断ELISA体系，用于区分猪瘟病毒2型野毒株感染猪的血清抗体和标记疫苗或E2蛋白亚单位疫苗免疫猪的血清抗体，属于兽用生物制品领域。

技术介绍

[0002]猪瘟(classical swine fever，CSF)是感染家猪及野猪的重要病毒病，具有高传染性和高致病性的特点，是世界动物卫生组织(OIE)规定必需报告的疫病之一，该病由黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起，在我国属一类动物传染病。
[0003]CSFV包含三个基因型(1型、2型和3型)，基因1型(CSFV1型)较为经典，而上世纪八十年代以来分离的毒株大多属于基因2型(CSFV2型)。CSFV弱毒C株(以下简称C株)是由CSFV1型强毒株在兔体连续传代致弱后得到，猪在接种C株后不会出现体温反应，仅出现轻微的病毒血症。C株被公认为安全有效的CSF疫苗，但不具备为相关检测试剂盒提供鉴别CSFV野毒感染血清抗体和疫苗C株免疫血清抗体的能力。国内生猪主产区的CSFV流行的毒株以CSFV2型为主，如QZ14株、HZ08株、HuN23株、HLJ1株等，CSFV2型等不同型毒株的流行可能影响基于基因1型的C株疫苗免疫保护效果。因此，具有鉴别能力、对基因2型等流行毒株的新型疫苗研制对更有效地控制CSF流行至关重要。
[0004]CSFV同属其他重要病原包括牛病毒性腹泻病毒1型及2型(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV；其1型和2型分别简称BVDV1和BVDV2)，它们与CSFV在血清学上有一定的交叉反应性。我国不少省份有猪感染BVDV的报道，主要可能为BVDV1型毒株，BVDV2型鲜有报道。CSFV和BVDV囊膜蛋白E
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均由227个氨基酸残基组成，具有高保守性，其上有中和表位，能产生的中和抗体，可用于开发基因工程亚单位疫苗。CSFV和BVDV的E
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之间同源性较高，但在特定区域有一定差异，可能是两者互相鉴别的靶点；在新型标记疫苗研制中，具有鉴别疫苗免疫动物和野毒感染动物的潜力。由欧盟多个科研机构联合研发的重组疫苗CP7_E2alf及其配套检测体系是研究较为深入的猪瘟标记疫苗，已获欧洲药品管理局许可(商品名CSF Marker)。CP7_E2alf的骨架为BVDV1型CP7株，通过反向遗传学方法将其E2基因替换为CSFV Alfort/187毒株的相应区域构建而成，具有较好的免疫原性。此重组疫苗的弊端在于，虽然目前已有与之相配套的以BVDV1型E
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为靶点的血清学鉴别检测体系，但由于其与CSFV血清存在一定的交叉反应性，限制了其适用性。同时，由于该疫苗株基因组中包含了CSFV强毒株Alfort/187的基因组分，使得重组疫苗与野毒株之间有可能通过同源或非同源重组方式突变为强毒株，有潜在的生物安全隐患。
[0005]酶联免疫吸附试验(Enzyme
‑
linked Immunosorbent Assays,ELISA)主要用于抗体检测，广泛应用于临床，快速便捷且灵敏度高，不需要特殊的仪器设备。目前CSFV抗体检测的商品化试剂盒多采用间接ELISA或阻断ELISA方法，其中阻断ELISA主要基于纯度较高的特异性单克隆抗体，与特定的包被抗原结合，可显著提高检测的特异性，减少间接ELISA
方法可能出现的非特异性反应。
[0006]本实验室将CSFV弱毒C株基因组中的E
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置换为BVDV1型的E
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，E2基因对应区域置换为CSFV2型毒株QZ14的E2高变区，利用反向遗传系统，获得了基于弱毒C株的重组标记疫苗候选株RecC
‑
M1(授权专利号ZL201910551633.4)。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一株针对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)2型(CSFV2型)E
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蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株9B1及其应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供一株猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1，其保藏编号为CCTCC NO：C 202247。
[0009]说明：猪瘟病毒2型(CSFV2型)E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1，是一株分泌抗CSFV2型E
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蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株9B1(简称单抗9B1)。
[0010]作为本专利技术的猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1的改进：该细胞株分泌的单抗属于κ型轻链的IgG1亚型。
[0011]本专利技术还同时提供了上述猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1构建方法：以CSFV2型E
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蛋白免疫小鼠，取其脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合和筛选获得。
[0012]作为本专利技术构建方法的改进：
[0013]以CSFV2型毒株cDNA为模板，用一对特异引物PCR扩增获得E
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蛋白编码区序列；引物对如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
[0014]E
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蛋白编码区cDNA序列如SEQ ID NO.3所示；
[0015]将E
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蛋白编码区序列克隆于载体pFastBacHTB，获得重组转移质粒pFastBac
‑
E
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；pFastBac
‑
E
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转座至E.coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒Bacmid
‑
E
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；该重组杆粒转染Sf9细胞，获得表达CSFV2型E
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蛋白的重组杆状病毒，其表达产物简称CE
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(“C”表示CSFV)。
[0016]本专利技术提供的猪瘟病毒2型E
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截短蛋白CtE
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表达载体的构建方法及其表达为：
[0017]以原核表达质粒pET
‑
30a(+)为载体，构建CSFV2型E
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蛋白截短片段编码区与GST(谷胱甘肽S
‑
转移酶)编码区串联的重组质粒，经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达，用镍柱纯化，获得CSFV2型E
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蛋白截短片段与GST的融合蛋白CtE
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(“C”表示CSFV；“t”表示截短，以区别于E
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1，其特征在于保藏编号为CCTCC NO：C202247。2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1，其特征在于：该细胞株分泌的单抗属于κ型轻链的IgG1亚型。3.如权利要求1所述的猪瘟病毒2型E
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蛋白的杂交瘤细胞株9B1构建方法，其特征在于：以CSFV2型E
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蛋白免疫小鼠，取其脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合和筛选获得。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：以CSFV2型毒株cDNA为模板，用一对特异引物PCR扩增获得E
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蛋白编码区序列；引物对如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；E
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蛋白编码区cDNA序列如SEQ ID NO.3所示；将E
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蛋白编码区序列克隆于载体pFastBacHTB，获得重组转移质粒pFastBac
‑
E
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；pFastBac
‑
E
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转座至E.coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒Bacmid
‑
E
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；该重组杆粒转染Sf9细胞，获得表达CSFV2型E
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蛋白的重组杆状病毒，其表达产物简称CE
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。5.猪瘟病毒2型E
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截短蛋白CtE
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表达载体的构建方法及其表达，其特征在于：以原核表达质粒pET
‑
30a(+)为载体，构建CSFV2型E
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蛋白截短片段编码区与GST编码区串联的重组质粒，经IPTG诱导表达，用镍柱纯化，获得CSFV2型E
rns
蛋白截短片段与GST的融合蛋白CtE
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。6.如权利要求5构建所得的融合蛋白CtE
r...

【专利技术属性】
技术研发人员：方维焕，王媛，李肖梁，许翰坤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：