两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途及试剂盒，用途包括中华绒螯蟹水瘪子病的诊断指标：与健康中华绒螯蟹相比，病蟹肝胰腺中2

【技术实现步骤摘要】
两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，更具体涉及水产养殖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)“水瘪子”病诊断中的应用，具体为通过定量PCR技术测得肝胰腺中的细胞色素CYP2(cytochrome P450 CYP2)编码基因表达量显著下降，而2
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氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1(2
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aminomuconic semialdehyde dehydrogenase
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like isoform X1，ASD
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X1)编码基因表达量显著上调，这两种酶表达量的变化可以作为诊断中华绒螯蟹“水瘪子”病的指标。此外，还涉及一种据此设计的用于这种疾病诊断的试剂盒，可以为中华绒螯蟹“水瘪子”病的相关研究提供技术支持。

技术介绍

[0002]中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，简称河蟹，是一种经济蟹类，又称河蟹、毛蟹、清水蟹、大闸蟹，为中国久负盛名的美食。河蟹杂食性动物，鱼、虾、螺、蚌、蠕虫、蚯蚓、昆虫及其幼虫等均可作为大闸蟹的动物性饵料。随着河蟹养殖产业的发展，河蟹的各种病害陆续出现，危害也日趋严重，有病毒性疾病(如白斑综合症病毒引起的白斑病)、细菌性疾病(如螺原体引起的抖抖病)、寄生虫性疾病(如微孢子虫)等。当然，最近几年对河蟹养殖危害最大的是肝胰腺萎缩综合征，俗称“水瘪子”病。在江苏、浙江、湖北、安徽省等地的河蟹主养地区，其发病情况和流行范围呈扩大之势，发生率高、涉及范围，给河蟹养殖户带来巨大的经济损失，引发了业界强烈的反响。“水瘪子”病在河蟹养殖的全年均有发生，其具体症状为：外观发暗，外壳发软(手指轻捏即下陷)，大多空肠，肝胰腺萎缩、发白甚至糜烂，附肢空瘪，失去经济价值。肝胰腺萎缩的实质是腺管萎缩。
[0003]"水瘪子"是已成为河蟹养殖中后期爆发的主要疾病之一，死亡率较高，即使不死亡也会大大降低商品蟹的规格，无膘无膏难以上市，造成了巨大的经济损失。以肝胰腺萎缩为特征的“水瘪子”病的发病原因至今还没有定论，也缺乏清晰的诊断方法。其症状一般表现为出现爬网、上草、上岸等现象，这些螃蟹基本空腹，或有肠炎，甲壳软，螯足和步足内因肌肉萎缩而显得空瘪，爬动缓慢，肝胰脏由黄白色或白色，吃料量下降，不脱壳或脱壳困难，捞出水后比健康蟹更容易死亡，严重的情况下病蟹步足薄而软，成灰黑色，鳃丝发黑且附着污物，后期肝胰脏萎缩甚至糜烂消失，腹腔积水严重并出现大量死亡。
[0004]虽然肝胰腺萎缩是河蟹“水瘪子”病的主要特征之一，但这种病灶以及所表现出的其它症状都不是“水瘪子”病所特有的，弧菌病、“抖抖病”以及营养不良都可能出现这种症状。这就产生了一个很严重的问题，那就是如何将这几种病与水瘪子病区别开来。虽然很多学者都在研究中华绒螯蟹“水瘪子”病，包括病因，诊断和治疗，但由于对“水瘪子”病缺乏一个确切的诊断标准，导致不同学者所研究的病例对象并不都是真正的“水瘪子”病，因为得出的结论各不相同，严重阻碍了对这种疾病发病原因的研究和防控技术的研究。就病因而言，不同学者得出的结论相差很大，有的认为是微孢子虫、有的认为是弧菌、有的认为是病毒，没有确切定论。也有学者认为是肝胆负担、饲料营养不均衡，环境胁迫、过量使用农药等引起。目前该病害病因和病原尚不明确，众说纷纭。常常有学者会把一些不是“水瘪子”病的
病症误认为是“水瘪子”病，并据此开展的病因学探查和防控技术研究，从而得出了不一样的结论。
[0005]因此，迫切需要一种能够很好地将“水瘪子”病与症状类似的非“水瘪子”病区分开来的诊断技术和相应的试剂盒，以便为学术界和动保企业开展河蟹“水瘪子”病的研究提供便利以及研究结果的统一。

技术实现思路

[0006]为了解决上述存在的技术问题，本专利技术的目的是在于提供了一种两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途，与健康河蟹相比，肝胰腺萎缩的河蟹其肝胰腺中细胞色素P450的CYP2(cytochrome P450 CYP2)基因表达显著下降，而2
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氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1(2
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aminomuconic semialdehyde dehydrogenase
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like isoform X1，ASD
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X1)编码基因表达显著上调，因此，这两个蛋白表达量的同时变化可作为中华绒螯蟹肝胰腺萎缩病的诊断指标。
[0007]本专利技术的另一个目的是在于提供了一种中华绒螯蟹“水瘪子”病的诊断试剂盒，不需要绘制标准曲线，只需要测定病蟹和健康蟹肝胰腺中目标基因的相对表达量即可，大大降低了工作量。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：
[0009]本专利技术的技术构思是这样的：鉴于肝胰腺萎缩是“水瘪子”病的主要症状之一，从典型的发病池塘中采集具有典型症状的“水瘪子”病河蟹，采集其肝胰腺组织。同时，从未发病的池塘，选择健康的河蟹同步采集其肝胰腺。然后，冰冻保存带回实验室，进行蛋白质组学对比分析。以观察与健康的河蟹相比，“水瘪子”病蟹的肝胰腺在蛋白质组学层面发生了哪些显著的变化，以期从中找出“水瘪子”病的生物标记分子，用于疾病的诊断。这个研究我们重复了2次，每次采集并分析了病蟹和健康蟹各5只。进行比较分析，病蟹与健康蟹相比，有46个蛋白的表达量发生显著变化(p<0.05，或p<0.01)，其中下调的蛋白为36个，上调的蛋白为10个。从两次研究结果中，找出病蟹和健康蟹之间差异表达最显著和最恒定的指标，而且病蟹中上调和下调指标各一个，以这两个指标的组合作为“水瘪子”病的生物标记，并作为其诊断指标。在2次研究中病蟹肝胰腺中表达上调均最显著的蛋白是2
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氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1(2
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aminomuconic semialdehyde dehydrogenase
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like isoform X1)，2次研究中表达下调均最显著的蛋白是细胞色素P450酶系CYP2(cytochrome P450 CYP2)。最后，用这两个指标对临床上的“水瘪子”病蟹进行验证，在“水瘪子”病病例中重现了2
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氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1表达上调，细胞色素P450酶系CYP2表达显著下调的结果。而且，在弧菌感染和“抖抖”病蟹中，发现这两个指标要么未出现变化，要么变化的趋势与“抖抖”病的不一致。验证的结果非常理想，和预期的完全一致。
[0010]两种蛋白在中华绒螯蟹“水瘪子”病诊断中的用途，包括中华绒螯蟹“水瘪子”病的诊断指标：与健康中华绒螯蟹相比，病蟹肝胰腺中2
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氨基粘液半醛脱氢酶
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like异构体X1(2
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aminomuconic semialdehyde dehydrogenase
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like isoform X1，ASD
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X1)基因的表达上调幅度为1.8...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途，包括中华绒螯蟹水瘪子病的诊断指标：与健康中华绒螯蟹相比，病蟹肝胰腺中2
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氨基粘液半醛脱氢酶
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like异构体X1基因的表达上调幅度为1.8
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2.8倍，同时细胞色素P450酶系CYP2的表达下调幅度为20.2
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45.5％。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的2
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氨基粘液半醛脱氢酶
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like异构体X1基因表达水平和细胞色素P450酶系CYP2基因表达水平是指采用定量PCR技术测得的mRNA水平。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：定量测定所述的2
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氨基粘液半醛脱氢酶
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like异构体X1基因表达水平的正向和反向序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：定量测定所述的2
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氨基粘液半醛脱氢酶
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like异构体X1基因表达水平的正向和反向引物是基于序列SEQ ID NO:3所对应的蛋白质序列来设计的。5.一种诊断中华绒螯蟹水瘪子病的实时定量PCR试剂盒，其特征在于：包括SYBR Premix Ex Taq
TM
II；1对2
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氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1扩增的正反向引物；1对细胞色素P450基因扩增的正反向引物；1对内参β
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actin基因的正反向引物；双蒸水ddH2O。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的SYBR Premix Ex Taq
TM
II，含有Real Time PCR反应的最适浓度Green I，是一种2
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浓度的Premix Type试剂；所述的2
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氨基粘液半醛脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张倩倩，李爱华，吴振兵，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：