C12orf40基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种C12orf40基因的应用。发明专利技术人在临床科研实践中，通过全外显子测序技术筛选鉴定到一个导致非梗阻性无精子症患者的致病基因C12orf40剪切位点变异(NM_001031748.4,c.1286+1G>A)，患者睾丸活检组织中未见单倍体精子，表现为非梗阻性无精子症。该基因特异性表达于睾丸组织，在其他组织中不表达，可作为非梗阻性无精症的生物标志物，有助于进一步研究非梗阻性无精子症的机理，探索非梗阻性无精症的治疗。非梗阻性无精症的治疗。非梗阻性无精症的治疗。

【技术实现步骤摘要】
C12orf40基因的应用


[0001]本专利技术涉及生殖遗传
，特别是涉及一种与非梗阻性无精症相关的 C12orf40基因的应用。

技术介绍

[0002]男性不育是一种由多因素引起的表型异质性疾病，包括少、弱、畸形精子 症、无精子症及其他原因不明的男性不育。其中，非梗阻性无精症(non
‑
obstruction azoospermia，NOA)是男性不育最严重的一种表型，主要由包括染色体异常、 Y染色体AZF微缺失、基因突变在内的遗传缺陷而引发的精子发生障碍所致， 临床上目前缺乏使患者恢复生精功能的治疗手段，主要通过供精生育下一代。 随着以全外显子测序为代表的新一代测序技术在遗传病致病基因筛查中的广泛 应用，一些导致NOA的致病基因突变陆续被发现，这为NOA患者的诊断、预 防和生育治疗提供了重要的分子依据。
[0003]然而，相当一部分NOA患者进行基因检测后，由于检出的基因变异缺少功 能研究证据，无法判断变异是否与NOA相关，称之为“临床意义不明变异”， 这为NOA患者的精准防治带了巨大的挑战。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种新的可用于检测或治疗非梗阻性无精症的生物标 志物。
[0005]本专利技术提供了一种C12orf40基因作为生物标志物在制备用于检测或治疗非 梗阻性无精症的产品中的应用。
[0006]本专利技术还提供了一种突变型C12orf40基因，所述突变型C12orf40基因的核 苷酸序列与野生型C12orf40基因的核苷酸序列相比具有c.1286+1G>A突变。
[0007]本专利技术还提供了一种突变型C12orf40蛋白，所述突变型C12orf40蛋白的氨 基酸序列与野生型C12orf40蛋白的氨基酸序列相比具有p.Lys405fs突变。
[0008]本专利技术还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的突 变型C12orf40基因。
[0009]本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中掺有如上所述的 突变型C12orf40基因。
[0010]本专利技术还提供了如上所述的C12orf40基因、突变型C12orf40蛋白、重组表 达载体或宿主细胞在制备非梗阻性无精症动物模型中的应用。
[0011]本专利技术还提供了如上所述的C12orf40基因或其编码的C12orf40蛋白的检测 试剂在制备用于检测非梗阻性无精症的产品中的应用。
[0012]在其中一个实施例中，所述检测试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂： 荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱 法。
[0013]本专利技术还提供了一种用于非梗阻性无精症的检测试剂，包括PCR引物对， 所述PCR引物对能够扩增如上所述的C12orf40基因的全长或部分片段。
[0014]在其中一个实施例中，所述PCR引物对的上游引物能够与所述C12orf40基 因的8号外显子区域互补配对，所述PCR引物对的下游引物能够与所述C12orf40 基因的10号外显子区域互补配对。
[0015]在其中一个实施例中，所述上游引物和所述下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
[0016]本专利技术还提供了一种用于检测非梗阻性无精症的试剂盒，其包括如上所述 的检测试剂，以及RNA提取试剂、逆转录酶、PCR反应缓冲液、dNTPs和DNA 聚合酶中的至少一种。
[0017]专利技术人在临床科研实践中，通过全外显子测序技术筛选鉴定到一个导致非 梗阻性无精子症患者的致病基因C12orf40剪切位点变异(NM_001031748.4, c.1286+1G>A)，患者睾丸活检组织中未见单倍体精子，表现为非梗阻性无精子 症，该基因特异性表达于睾丸组织，在其他组织中不表达。为了明确该剪切位 点变异的致病性，我们抽提了患者的外周血RNA，并设计了特异性的PCR引物 (SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)，采用RT
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PCR技术(第一次扩增以患者 外周血cDNA为模板，第二次扩增以第一次扩增产物为模板，且两次扩增均采 用上述同一对引物)检测该剪切位点变异是否影响RNA剪接，结果发现能够扩 增出目的片段，且与正常对照相比，存在异常剪接转录本，表明该剪切位点变 异影响了RNA剪接。进一步对正常对照和患者的上述扩增产物进行Sanger测序， 结果显示，C12orf40纯合剪切位点变异(c.1286+1G>A)影响了RNA剪接，导 致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短。由 此可知，C12orf40基因可作为非梗阻性无精症的生物标志物，C12orf40纯合剪 切位点突变(c.1286+1G>A)会导致非梗阻性无精症，且采用上述特异性引物序 列结合RT
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PCR技术，可用于外周血不表达或过低表达的NOA致病基因 C12orf40的剪切位点变异致病性检测。
附图说明
[0018]图1为本专利技术在1例NOA患者中发现的C12orf40基因纯合剪切位点变异 结果；其中A为通过Sanger测序证实该患者携带C12orf40基因纯合剪切位点 (c.1286+1G>A)突变，B为C12orf40在不同组织中的表达谱，C为携带C12orf40 基因纯合剪切位点变异患者(P)的睾丸病理染色结果，与对照(NC)相比， 患者睾丸生精细胞中未见单倍体精子，表现为减数分裂阻滞；
[0019]图2为本专利技术检测非梗阻性无精子症患者中发现的C12orf40纯合剪切位点 变异的剪切模式结果；其中A为RT
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PCR检测C12orf40在患者和正常对照外周 血RNA中的表达及推测可能的剪切模式，B为通过Sanger测序检测患者和正常 对照中的PCR产物序列，并明确该剪切位点的剪切模式，C为通过生物信息学 分析C12orf40纯合剪切位点(c.1286+1G>A)影响RNA剪接，导致第9号外显 子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短。
具体实施方式
[0020]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本发 明的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文 所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的 理解更加透彻全面。
[0021]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的技术 领域
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的 术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0022]本专利技术提供了C12orf40基因作为生物标志物在制备用于检测或治疗非梗阻 性无精症的产品中的应用。可选地，上述产品可以是试剂、试剂盒、药本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.C12orf40基因作为生物标志物在制备用于检测或治疗非梗阻性无精症的产品中的应用。2.一种突变型C12orf40基因，其特征在于，所述突变型C12orf40基因的核苷酸序列与野生型C12orf40基因的核苷酸序列相比具有c.1286+1G>A突变。3.一种突变型C12orf40蛋白，其特征在于，所述突变型C12orf40蛋白的氨基酸序列与野生型C12orf40蛋白的氨基酸序列相比具有p.Lys405fs突变。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的突变型C12orf40基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中掺有权利要求2所述的突变型C12orf40基因。6.权利要求1所述的C12orf40基因、权利要求3所述的突变型C12orf40蛋白、权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书八页序列表二页附图一页，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：