靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法技术

本发明专利技术涉及靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，包括以下步骤：提取全血游离DNA，检测合格后经重亚硫酸盐处理后，用作扩增模板；设计并合成靶向膜蛋白基因的标签引物；将扩增模板与标签引物混合后进行PCR扩增，连接illumina测序平台专用index测序接头，构建不同标签的扩增子文库；将不同标签的扩增子文库定量混合再进行上机测序，获得测序结果；通过生物信息学对得到测序结果进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况；采用t检验法检测每个扩增子的位点差异，并统计其平均甲基化水平，对各个对比组之间进行差异化分析。采用扩增子甲基化测序的方法对印记基因SLC22A18的甲基化位点进行筛选，具有准确性高、通量高、周期短、成本低的优势。成本低的优势。成本低的优势。

【技术实现步骤摘要】
靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法


[0001]本专利技术属于医疗检测
，具体涉及靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法。

技术介绍

[0002]印记基因是指仅来自一方亲本的同源基因表达,而来自另一亲本的同源基因不表达。印记基因的存在反映了性别的竞争,从目前发现的印记基因来看,父方对胚胎的贡献是加速其发育,而母方则是限制胚胎发育速度,亲代通过印记基因来影响其下一代,使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。
[0003]印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用,对行为和大脑的功能也有很大的影响。
[0004]经过本团队的深入研究首次定义了印记基因SLC22A18相关的儿童“过敏
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矮小
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脂肪肝”综合征，患儿们的外周血细胞SLC22A18
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DNA启动子及CpG岛高甲基化，提示印记遗传的SLC22A18高甲基化影响了该基因的转录过程，造成膜蛋白SLC22A18功能受到抑制，从而引起“过敏
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矮小
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脂肪肝”印记基因综合征的发生。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，克服了现有技术的不足，采用扩增子甲基化测序的方法对印记基因SLC22A18的甲基化位点进行筛选，具有准确性高、通量高、周期短、成本低的优势。<br/>[0006]为解决上述问题，本专利技术所采取的技术方案如下：
[0007]靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一、提取全血游离DNA，检测合格后经重亚硫酸盐处理后，用作扩增模板；
[0009]步骤二、设计并合成靶向膜蛋白基因的标签引物；
[0010]步骤三、将扩增模板与标签引物混合后进行PCR扩增，连接illumina测序平台专用index测序接头，构建不同标签的扩增子文库；
[0011]步骤四、将不同标签的扩增子文库定量混合再进行上机测序，获得测序结果；
[0012]步骤五、通过生物信息学对得到测序结果进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况；
[0013]步骤六、采用t检验法检测每个扩增子的位点差异，并统计其平均甲基化水平，对各个对比组之间进行差异化分析。
[0014]进一步，步骤一中所述重亚硫酸盐处理将DNA样本中未发生甲基化的C变成U，且甲基化的C保持不变。
[0015]进一步，步骤二中所述标签引物包括具有分子标签的5
’
端修饰基团、用于匹配扩增模板的核苷酸片段和3
’
端修饰基团。
[0016]进一步，步骤三中所述PCR扩增的试剂包括高保真耐U碱基的DNA聚合酶、DNA保护缓冲液、清洗液。
[0017]进一步，步骤四中所述生物信息学对得到测序结果进行分析，具体步骤包括：
[0018](1)对测序结果进行预处理，对原始序列进行裁剪；
[0019](2)使用质检软件进行预处理的数据质量控制，保证测序无适配子序列；
[0020](3)根据数据制盒形图与蜂群图，展示各区域在组间的甲基化分布情况；
[0021](4)根据图示对进行组间比较，展示差异甲基化结果。
[0022]本专利技术与现有技术相比较，具有以下有益效果：
[0023]1.本专利技术采用扩增子甲基化测序的方法对印记基因SLC22A18的甲基化位点进行筛选，从而对印记基因综合征进行早期筛查，获得更准确有效的检测结果。
[0024]2.本专利技术可满足几个到几百个CpG位点或目标区域的验证需求，获得样本多个基因目标区域甲基化突变序列信息，能够准确有效分析目标区域甲基化状态，使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实，极大降低成本。
附图说明
[0025]图1为第一比较组扩增子甲基化分布情况的盒子图。
[0026]图2为第一比较组扩增子甲基化分布情况的蜂群图。
[0027]图3为第二比较组扩增子甲基化分布情况的盒子图。
[0028]图4为第二比较组扩增子甲基化分布情况的蜂群图。
[0029]图5为第三比较组扩增子甲基化分布情况的盒子图。
[0030]图6为第二比较组扩增子甲基化分布情况的蜂群图。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]实施例1
[0033]本实施例公开了靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，包括以下步骤：
[0034]步骤一、提取全血游离DNA，检测合格后经重亚硫酸盐处理后，用作扩增模板；重亚硫酸盐处理将DNA样本中未发生甲基化的C变成U，且甲基化的C保持不变。
[0035]步骤二、设计并合成靶向膜蛋白基因的标签引物；标签引物包括具有分子标签的5
’
端修饰基团、用于匹配扩增模板的核苷酸片段和3
’
端修饰基团。
[0036]步骤三、将扩增模板与标签引物混合后进行PCR扩增，连接illumina测序平台专用index测序接头，构建不同标签的扩增子文库；PCR扩增的试剂包括高保真耐U碱基的DNA聚合酶、DNA保护缓冲液、清洗液。
[0037]步骤四、将不同标签的扩增子文库定量混合再进行上机测序，获得测序结果；
[0038]步骤五、通过生物信息学对得到测序结果进行分析，获得目标区域内甲基化突变
情况；
[0039]步骤六、采用t检验法检测每个扩增子的位点差异，并统计其平均甲基化水平，对各个对比组之间进行差异化分析。
[0040]生物信息学对得到测序结果进行分析，具体步骤包括：
[0041](1)对测序结果进行预处理，对原始序列进行裁剪；
[0042](2)使用质检软件进行预处理的数据质量控制，保证测序无适配子序列；
[0043](3)根据数据制盒形图与蜂群图，展示各区域在组间的甲基化分布情况；
[0044](4)根据图示对进行组间比较，展示差异甲基化结果。
[0045]实施例2
[0046]选取三个比较组，按照实施例1的检测方法进行样本采集、合成标签引物、构建扩增子文库、上机测序，再通过生物信息学进行分析，制得三个比较组的盒子图和蜂群图(如图1
‑
6)所示。
[0047]根据检测结果进行各个对比组之间进行差异化分析，检测结果符合临床信息。
[0048]对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、提取全血游离DNA，检测合格后经重亚硫酸盐处理后，用作扩增模板；步骤二、设计并合成靶向膜蛋白基因的标签引物；步骤三、将扩增模板与标签引物混合后进行PCR扩增，连接illumina测序平台专用index测序接头，构建不同标签的扩增子文库；步骤四、将不同标签的扩增子文库定量混合再进行上机测序，获得测序结果；步骤五、通过生物信息学对得到测序结果进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况；步骤六、采用t检验法检测每个扩增子的位点差异，并统计其平均甲基化水平，对各个对比组之间进行差异化分析。2.根据权利要求1所述的靶向膜蛋白甲基化作为印记基因综合征标志物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述重亚硫酸盐处理将DNA样本中未发生甲基化的C变成U，且甲基化的C保持不变。3.根据权利要求1所述的靶向膜蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔荆，沈瑶，殷俊，
申请(专利权)人：上海市东方医院同济大学附属东方医院，
类型：发明
国别省市：