一种化学修饰的甘油-3-磷酸氧化酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种化学修饰的甘油

【技术实现步骤摘要】
一种化学修饰的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶及其应用


[0001]本专利技术涉及一种化学修饰的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶及其应用，属于诊断用酶


技术介绍

[0002]甘油
‑3‑
磷酸氧化酶，即Glycerol
‑3‑
phosphate Oxidase(G3PO)，是临床检测血清中甘油三酯含量的重要酶原料，测定血清中的甘油三酯含量可为临床诊断疾病提供依据。
[0003]甘油三酯(TG)是脂质的组成成分，是甘油分子中的3个羟基被脂肪酸酯化而形成。它在人体血脂检测和监控中具有重要的临床意义，根据《中国成人血脂异常防控指南(2016年修订版)》的划分标准：空腹甘油三酯<1.7mmol/L(或150mg/dl)为合适水平；≥1.7mmol/L(或150mg/dl)且<2.3mmol/L(或200mg/dl)为边缘升高；≥2.3mmol/L(或200mg/dl)为升高。甘油三酯水平轻度至中度升高会增加患冠心病的危险性，同时甘油三酯升高可见于肥胖、糖尿病、肾功能衰竭、肝脏疾病、甲状腺功能减退症、脂肪萎缩症、骨髓瘤、多囊卵巢综合征等疾病，因此当其升高时应及时采取对应的治疗措施如控制饮食或药物治疗。
[0004]血清中甘油三酯的测定方法有化学法和酶法，但化学法由于特异性差、手续复杂等因素而被市场所淘汰，目前临床上检测TG的方法主要是酶法。酶法检测TG主要包括以下几个基本反应步骤：血清中的甘油三酯经脂蛋白酯酶(Lipoprotein Lipase，LPL)水解成甘油和3个游离脂肪酸(Free Fatty Acid，FFA)；甘油在ATP和甘油激酶(Glycerokinase，GK)的作用下生成3
‑
磷酸甘油和ADP；3
‑
磷酸甘油再在甘油
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磷酸氧化酶(Glycerol
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phosphate Oxidase，G3PO)的作用下进一步反应，被氧气氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢(H2O2)；过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的催化下又与4
‑
氨基安替比林(4
‑
AAP)和色原(如N
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乙基
‑
N
‑
(2
‑
羟基
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磺丙基)
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甲基苯胺钠盐(TOOS))发生Trinder反应，生成红色醌亚胺化合物，其显色程度与TG的浓度呈正比，反应生成的醌亚胺化合物的量可用紫外分光光度计在555nm检测。反应原理如下：
[0005][0006][0007][0008][0009]有文献报道，G3PO催化甘油
‑3‑
磷酸氧化生成H2O2的反应是甘油三酯检测过程的限速步骤，该酶的热稳定性很大程度上影响着酶法测定的结果。野生型G3PO在检测试剂(水溶液)中稳定性较差，在46℃水浴30min就会失去大部分活性，不适合应用到自动生化分析仪上检测甘油三酯。根据市场调研，目前市售的热稳定性较好的G3PO产品比较少，这些产品在46℃水浴30min后能保留50％以上的活性，而野生型G3PO的热稳定性达不到这个程度。
[0010]因此，为了满足市场对热稳定性好的甘油
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磷酸氧化酶的需求，本领域迫切需要
研究开发新的G3PO生产技术，以期获得在水溶液中稳定性好的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶。

技术实现思路

[0011]本专利技术所要解决的技术问题是，解决上述现有技术的不足，提供一种在水溶液中热稳定性好的甘油
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磷酸氧化酶(G3PO)的制备方法及应用该方法修饰的酶，使其利于在甘油三酯检测试剂中的应用。
[0012]本专利技术提供了一种热稳定性提高的甘油
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磷酸氧化酶改性酶，该酶在K3、K7、K10、K17、K45、K135、K212、K225、K248、K267、K486、K523、K573、K595中一个或多个位点的赖氨酸发生了修饰改性；所述修饰改性是指赖氨酸的ε
‑
氨基与含羧基或酯基的化合物发生酰胺化交联。
[0013]在一种实施方式中，所述ε
‑
氨基的修饰率≥40.3％，或≥63.6％，或≥64.7％，或≥68.5％，或≥71.6％，或≥72.4％，或≥73.5％，或≥76.9％，或≥86.3％。
[0014]在一种实施方式中，所述化合物包括但不限于大分子修饰剂或小分子修饰剂。
[0015]在一种实施方式中，所述大分子修饰剂包括但不限于右旋糖苷、牛血清白蛋白(BSA)、甲氧基PEG活性酯(mPEG
‑
NHS)、聚丙烯酸(PA)。
[0016]在一种实施方式中，所述小分子修饰剂包括但不限于均苯四甲酸酐(PMDA)、丁二酸酐(SAA)或丁二酸钠。
[0017]在一种实施方式中，所述甘油
‑3‑
磷酸氧化酶来源于绿色气球菌(Aerococcus viridans)，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0018]本专利技术还提供了一种提高甘油
‑3‑
磷酸氧化酶热稳定性的方法，所述方法是用含羧基或酯基的化合物与甘油
‑3‑
磷酸氧化酶氨基酸序列中一个或多个赖氨酸的ε
‑
氨基发生交联，形成具有酰胺基的修饰改性酶。
[0019]在一种实施方式中，所述赖氨酸是位于甘油
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磷酸氧化酶氨基酸序列中第3位、第7位、第10位、第17位、第45位、第135位、第212位、第225位、第248位、第267位、第486位、第523位、第573位、第595位中的一个或多个赖氨酸。
[0020]本专利技术还提供了一种制备所述热稳定性提高的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶改性酶的方法，所述方法是用含羧基或酯基的化合物对甘油
‑3‑
磷酸氧化酶在K3、K7、K10、K17、K45、K135、K212、K225、K248、K267、K486、K523、K573、K595中一个或多个位点的赖氨酸进行修饰改性；所述改性是将含羧基或酯基的化合物与所述赖氨酸的ε
‑
氨基进行酰胺化交联。
[0021]在一种实施方式中，所述方法是利用高碘酸钠将右旋糖酐(Dextran，平均分子量40000)醛基化后，将形成的醛基再与所述赖氨酸的ε
‑
氨基共价结合生成改性酶。
[0022]在一种实施方式中，所述方法是利用高碘酸钠将右旋糖酐(Dextran，平均分子量40000)醛基化后，再增加一个连接臂6
‑
氨基己酸使右旋糖酐羧基化，将形成的羧基化合物再在交联剂的作用下与所述赖氨酸的ε
‑
氨基进行偶联生成改性酶。
[0023]在一种实施方式中，所述方法是利用均苯四本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶改性酶，其特征在于，对出发酶K3、K7、K10、K17、K45、K135、K212、K225、K248、K267、K486、K523、K573、K595中一个或多个位点的赖氨酸进行了修饰改性；所述修饰改性是指赖氨酸的ε
‑
氨基与含羧基或酯基的化合物发生酰胺化交联。2.根据权利要求1所述的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶改性酶，其特征在于，所述甘油
‑3‑
磷酸氧化酶来源于绿色气球菌(Aerococcus viridans)；所述化合物为大分子修饰剂或小分子修饰剂。3.根据权利要求2所述的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶改性酶，其特征在于，所述大分子修饰剂包括但不限于右旋糖苷、牛血清白蛋白、甲氧基PEG活性酯或聚丙烯酸；所述小分子修饰剂包括但不限于均苯四甲酸酐、丁二酸酐或丁二酸钠。4.一种提高甘油
‑3‑
磷酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于，用含羧基或酯基的化合物与甘油
‑3‑
磷酸氧化酶氨基酸序列中一个或多个赖氨酸的ε
‑
氨基发生交联，形成具有酰胺基的修饰改性酶。5.一种制备热稳定性提高的甘油
‑3‑
磷酸氧化酶改性酶的方法，其特征在于，用含羧基或酯基的化合物对甘油
‑3‑
磷酸氧化酶在K3、K7、K10、K17、K45、K135、K212、K225、K248、K267、K486、K523、K573、K595中一个或多个位点的赖氨酸进行修饰改性；所述修饰改性是将含羧基或酯基的化合物与所述赖氨酸的ε
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氨基进行酰胺化交联。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体为(a)～(g)任一：(a)将聚丙烯酸上的羧基先与EDC反应生成中间体，再用...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗漫杰，徐灿，覃延丽，施婧妮，王梁，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：