一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法。本发明专利技术的发酵方法分为酵母菌活化，驯化，接种发酵和纯化等步骤，且制备了特殊的底层填充凝胶的发酵培养基，配合金属离子溶液，实现了增强酶活并同时交联凝胶基质的协同作用，分析了盐析、离子层析、凝胶过滤等多种纯化方式，选择了最优条件，制备了高纯度高酶活的乳酸脱氢酶，是一种短周期产酶，高纯度提酶，更适用于工业化、规模化生产的新型乳酸脱氢酶发酵制备方式。式。式。

A method for preparing lactate dehydrogenase by yeast fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法。

技术介绍

[0002]乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，简称LDH)普遍存在于微生物及动物脏器中，是一种糖酵解酶，主要作用是催化乳酸氧化成丙酸，可分为D
‑
乳酸脱氢酶(D
‑
LDH)和L
‑
乳酸脱氢酶(L
‑
LDH)，目前主要应用到白血病、心肌梗塞、肿瘤等的诊断中；可以作为食品添加剂于发酵奶制品、腌渍品、糖果制品和饮料等生产中，是生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒的主要原料。
[0003]目前制备乳酸脱氢酶方法有很多，传统的方法为利用动物的脏器制备乳酸脱氢酶，其缺陷在于脏器中其它组织的干扰因素较多，要去除其它无用组织并切碎，费时费力，LDH提取率较低，而且动物脏器成本较高，不易得到，无法应用到工业大规模生产。
[0004]利用微生物发酵的方法也有报道，例如CN102653735A公开了一种海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，对菌种进行6～10次活化，再经定向驯化4～6次，在18～24℃逐级扩大培养，接入液体发酵培养基，在18～24℃培养至海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；后处理为离心，洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，石英研磨，收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0005]上述方法需要特殊菌种且需要对菌种进行长周期的活化和驯化，关键的，其得到粗酶液后，并未提出对提纯步骤的改进，公知的，在工业化生产中后续提纯处理的步骤是决定整个制备周期长短的关键步，相对于生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂所需的纯度，其提纯需要盐析、透析抽取、离子交换层析或其他如凝胶色谱过滤等提纯方法。综上，上文所述方法不适于工业生产，且耗时耗力成本较高。
[0006]因此，寻求一种易得到的菌种发酵制备乳酸脱氢酶，并具有简单的生产工艺流程，且成本较低可用于工业上生产的方法是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，提升乳酸脱氢酶提取率，简化纯化步骤以及便于工业化、规模化生产乳酸脱氢酶，本专利技术以易得的酵母菌作为发酵菌种，合理配置培养基，经活化，驯化，接种发酵和纯化等步骤，实现了短周期产酶，高纯度提酶，更适用于工业化、规模化生产的新型乳酸脱氢酶制备方式。
[0008]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0009]1.一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：
[0010](1)酵母菌置于培养基A进行2次活化，酵母菌为市售酵母菌，优选的，为酿酒酵母菌；
[0011](2)将活化后的酵母菌原始菌种接入培养基B，培养24～48h，得到液体菌液；
[0012](3)液体菌液按1/10mL～1/8mL接入凝胶发酵培养基，再加入总浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn
2+
、Ca
2+
、Mg
2+
、Fe
2+
和Fe
3+
中的至少一种，培养24h～48h；
[0013](4)培养完成后，将凝胶发酵培养基用缓冲液洗脱，得发酵液，离心，洗涤，收集沉淀细胞；
[0014](5)将沉淀细胞破碎，离心，收集上清液，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
[0015](6)将得到的粗酶液纯化，纯化方式包括但不限于盐析、透析抽取、离子层析、凝胶过滤，制得乳酸脱氢酶。
[0016]步骤(1)中，培养基A为麦芽汁液体培养基，组分包括麦芽膏粉、琼脂粉、氯霉素和蒸馏水，其中按质量比，麦芽膏粉：琼脂粉：氯霉素为1000～1300：100～150：1。
[0017]步骤(2)中，培养基B为基础培养基，组分包括麦芽糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、KH2PO4·
H2O、MgSO4、蒸馏水，其中按质量比，麦芽糖：酵母粉：琼脂粉：NaCl、KH2PO4·
H2O、MgSO4为8～10：5～10：2～3：1：2：1；
[0018]步骤(3)中，发酵培养基组分包括但不限于凝胶、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、KH2PO4·
H2O、吐温60、MgSO4、NaCl、丙酸钠、蒸馏水，其中按质量比，蛋白胨：酵母粉：葡萄糖：KH2PO4·
H2O：吐温60：MgSO4：NaCl：丙酸钠为4～6：3～4：90～100：1～2：3～6：1：1：1.5～2；
[0019]上述培养基配置完成后，于121℃下灭菌20min。
[0020]步骤(3)中，凝胶为添加蒸馏水、交联剂至聚糖类物质中制备的交联多糖，即天然生物质凝胶，天然生物质凝胶填充至发酵培养基底层，占培养基总容量的1/6～1/5，凝胶上层为发酵培养基组分，本专利技术在凝胶基质的选择上做了详细实验，实验结果表明，单体聚合类凝胶因其可控稳定的分子量，具有更好的过滤性，但因可能残留的有害单体，不适用于发酵体系，不适合酵母菌的生长。
[0021]优选的，所述凝胶交联剂包括但不限于硼砂、磷酸酯、N,N聚丙烯酰胺，凝胶的选择为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、瓜尔胶、苹果胶等交联的聚糖类物质，为实现发酵时兼顾提纯的目的，其他的生物质凝胶也包含在本专利技术的选择之内。
[0022]本专利技术凝胶作用为在发酵过程中逐步的将大分子物质和小分子物质分开，使得发酵完成后，酶的纯度更高，同时添加金属离子一方面提高酶的活性，另一方面，在凝胶
‑
培养液离子迁移速率平衡后，金属离子与凝胶多糖的螯合作用可以保证凝胶的孔径稳定，防止凝胶在过渡溶胀后孔径扩大，导致所得产物过多渗析。
[0023]进一步的，步骤(3)中，接入液体菌液后，蒸馏水配置溶液，总浓度为0.1mmol/L～1.5mmol/L，溶质为Zn
2+
、Ca
2+
、Mg
2+
、Fe
2+
和Fe
3+
对应金属离子化合物中的至少一种，其金属离子化合物包括但不限于氯化物、硫酸盐，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶
‑
培养液离子迁移速率平衡；
[0024]优选的，所述溶质为Zn
2+
、Ca
2+
、Mg
2+
、Fe
2+
对应金属离子化合物中的至少一种；
[0025]优选的，所述溶质为Zn
2+
、Ca
2+
、Mg
2+
对应金属离子化合物中的至少一种；
[0026]优选的，所述溶质为Zn
2+
或Ca
2+
对应金属离子化合物；
[0027]优选的，所述溶质为ZnCl2或ZnSO4；
[0028]优选的，上述凝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：(1)酵母菌置于培养基A进行2次活化；(2)将活化后的酵母菌原始菌种接入培养基B，培养24～48h，得到液体菌液；(3)液体菌液按1/10mL～1/8mL接入凝胶发酵培养基，再加入总浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn
2+
、Ca
2+
、Mg
2+
、Fe
2+
和Fe
3+
中的至少一种，培养24h～48h；(4)培养完成后，将凝胶发酵培养基用缓冲液洗脱，得发酵液，离心，洗涤，收集沉淀细胞；(5)将沉淀细胞破碎，离心，收集上清液，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；(6)将得到的乳酸脱氢酶粗酶液纯化，即得到乳酸脱氢酶，纯化方式包括盐析、透析抽取、离子层析和凝胶过滤。2.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养基A为麦芽汁液体培养基，组分包括麦芽膏粉、琼脂粉、氯霉素和蒸馏水，其中按质量比，麦芽膏粉：琼脂粉：氯霉素为1000～1300：100～150：1。3.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养基B为基础培养基，组分包括麦芽糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、KH2PO4·
H2O、MgSO4、蒸馏水，其中按质量比，麦芽糖：酵母粉：琼脂粉：NaCl、KH2PO4·
H2O、MgSO4为8～10：5～10：2～3：1：2：1。4.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，凝胶发酵培养基组分包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、KH2PO4·
H2O、吐温60、MgSO4、NaCl、丙酸钠，其中按质量比，蛋白胨：酵母粉：葡萄糖：KH2PO4·
H2O：吐温60：MgSO4：Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：董雯，刘兴佳，谢清华，胡晓飞，
申请(专利权)人：山东华宜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：