一种酶催化体系、加氢酶及制备方法和应用技术

本申请公开了一种酶催化体系、加氢酶及制备方法和应用。酶催化体系包括：用于催化底物经过还原反应生成产物的加氢酶、有机溶剂、辅酶和辅酶再生剂。加氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。通过酶催化还原反应得到可作为依折麦布中间体的(4S)

【技术实现步骤摘要】
一种酶催化体系、加氢酶及制备方法和应用


[0001]本申请涉及酶工程及生物制药
，具体涉及一种酶催化体系、加氢酶及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]依折麦布，又名依替米贝、依泽替米贝，英文名为：Ezetimibe，化学名称：1
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
(3R)
‑3‑
(4
‑
氟苯基)
‑
(3S
‑
羟基丙基]‑
(4S(4
‑
羟基苯基)
‑2‑
丙内酰胺，CAS：163222
‑
33
‑
1，分子式为C
24
H
21
F2NO3，分子量为409.43，为白色晶状粉末，是高纯化、高选择性胆固醇吸收抑制剂药物，它是第一个被美国FDA批准上市的能够选择性抑制胆固醇吸收的药物。主要用于降低人体胆固醇的含量，对治疗原发性高胆固醇血症、家族性纯合子高胆固醇血症(HoFH)、纯合子谷甾醇血症(或植物甾醇血症)都有一定作用；对动脉粥样化性疾病和冠心病等疾病的防治和治疗都有重要的意义。
[0003]依折麦布分子结构中有一个手性苄位羟基和两个修饰刚性2
‑
氮杂环丁酮母核的立体中心，可存在8个立体异构体，因此，其绝对构型的建立和控制成为合成领域最具挑战性的工作之一。
[0004]在依折麦布合成的大部分路线中，(4S)
‑3‑
[(5s)
‑5‑
(4
‑
氟苯基)
‑5‑
羟基戊酰基]‑4‑
苯基
‑
1，3
‑
氧氮杂环戊烷
‑2‑
酮作为依折麦布的关键手性中间体，它可以由化学和酶催化动力学拆分其前体酮制备得到。其中，化学不对称还原法得到的目标产物光学纯度不够高，同时化学法成本较高，并且化学催化剂容易对环境造成严重的污染。与化学法相比，生物法表现出明显的立体专一性强、催化效率高和无污染等优点。但目前的生物法制备仍存在一些缺陷，例如酶活损失严重，导致转化率降低，需要不断增加酶量才能维持反应的进行。因此找到既能减少酶的用量又能提高产物转化率的体系对减少成本和提高产物回收有重大意义。

技术实现思路

[0005]本申请提供一种酶催化体系、加氢酶及制备方法和应用，可以改善目前反应中酶用量较大及转化率较低等问题。
[0006]第一方面，本申请提供一种酶催化体系，酶催化体系包括：用于催化底物经过还原反应生成产物的加氢酶、有机溶剂、辅酶和辅酶再生剂；底物为(4S)
‑3‑
[5
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
1，5
‑
二氧代戊基]‑4‑
苯基
‑2‑
恶唑烷酮，其结构如式(1)所示：
[0007][0008]产物为(4S)
‑3‑
[(5s)
‑5‑
(4
‑
氟苯基)
‑5‑
羟基戊酰基]‑4‑
苯基
‑
1，3
‑
氧氮杂环戊烷
‑2‑
酮，其结构如式(2)所示：
[0009][0010]进一步地，加氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
[0011]进一步地，底物的浓度可以为50g/L～250g/L，也可以为100g/L～200g/L，还可以为120g/L～180g/L。
[0012]进一步地，以反应体系的总体积计，有机溶剂的浓度可以为20％(v/v)～50％(v/v)，也可以为25％(v/v)～45％(v/v)，还可以为30％(v/v)～40％(v/v)；反应体系为发生催化还原反应过程中的体系，包括酶催化体系、底物、水等。
[0013]进一步地，有机溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、N，N
‑
二甲基甲酰、二氯甲烷或甲苯中的至少一种。
[0014]进一步地，辅酶选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)中的任意一种。
[0015]进一步地，辅酶的浓度可以为0.2～2g/L，也可以为0.5～1.7g/L，还可以为1.0～1.5g/L。
[0016]进一步地，辅酶再生剂包括：异丙醇和羰基还原酶。
[0017]进一步地，羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0018]进一步地，以反应体系的总体积计，羰基还原酶的体积百分比含量可以为0.5％～1％，也可以为0.6％～0.9％，还可以为0.7％～0.8％。
[0019]进一步地，辅酶再生剂包括：葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
[0020]进一步地，葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0021]进一步地，以反应体系的总体积计，葡萄糖脱氢酶的体积百分比含量可以为0.2％～0.6％，也可以为0.3％～0.5％，还可以为0.4％。
[0022]进一步地，葡萄糖的浓度可以为30～50g/L，也可以为35～45g/L，还可以为37～43g/L。
[0023]第二方面，本申请提供一种加氢酶，加氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
[0024]进一步地，加氢酶的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变得到的氨基酸序列。
[0025]进一步地，点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1中的第30位氨基酸F、第50位氨基酸V、第94位氨基酸D、第158位氨基酸H、第169位氨基酸A、第172位氨基酸S、第229位氨基酸D、第241位氨基酸L、第243位氨基酸R中的一个或多个。
[0026]进一步地，发生点突变的方式为F30T、V50P、D94Q、H158I、A169T、S 172R、D229V、L241I或R243Y。
[0027]进一步地，加氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
[0028]作为替代性实施方案，发生点突变的方式为以下任一所示组合：
[0029](1)F30T和S172R；
[0030](2)H158I、L241I和R24本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶催化体系，其特征在于，所述酶催化体系包括：用于催化底物经过还原反应生成产物的加氢酶、有机溶剂、辅酶和辅酶再生剂。2.根据权利要求1所述的酶催化体系，其特征在于，所述底物为(4S)
‑3‑
[5
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
1，5
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二氧代戊基]
‑4‑
苯基
‑2‑
恶唑烷酮，其结构如式(1)所示：所述产物为(4S)
‑3‑
[(5s)
‑5‑
(4
‑
氟苯基)
‑5‑
羟基戊酰基]
‑4‑
苯基
‑
1，3
‑
氧氮杂环戊烷
‑2‑
酮，其结构如式(2)所示：所述加氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与所述SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的酶催化体系，其特征在于，所述底物的浓度为50g/L～250g/L；和/或，以反应体系的总体积计，所述有机溶剂的体积百分比含量为20％～50％；和/或，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、N，N
‑
二甲基甲酰、二氯甲烷或甲苯中的至少一种；和/或，所述辅酶选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的任意一种；和/或，所述辅酶的浓度为0.2～2g/L；和/或，所述辅酶再生剂包括：异丙醇和羰基还原酶，或者，葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。4.根据权利要求3所述的酶催化体系，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或，以反应体系的总体积计，所述羰基还原酶的体积百分比含量为0.5％～1％；和/或，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，以反应体系的总体积计，所述葡萄糖脱氢酶的体积百分比含量为0.2％～0.6％；和/或，所述葡萄糖的浓度为30～50g/L。
5.一种加氢酶，其特征在于，所述加氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与所述SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的加氢酶，其特征在于，所述加氢酶的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变得到的氨基酸序列；可选地，发生所述点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1中的第30位氨基酸F、第50位氨基酸V、第94位氨基酸D、第158位氨基酸H、第169位氨基酸A、第172位氨基酸S、第229位氨基酸D、第241位氨基酸L、第243位氨基酸R中的一个或多个；可选地，发生所述点突变的方式为F30T、V50P、D94Q、H158I、A169T、S172R、D229V、L241I或R243Y。7.根据权利要求6所述的加氢酶，其特征在于，所述加氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；和/或，发生所述点突变的方式为以下任一所示组合：(1)F30T和S172R；(2)H158I、L241I和R243Y；(3)V50P、D94Q和A169T；(4)A169T、S172R、D229V和L241I；或(5)F30T、D94Q、A169T、L241I和R243Y；和/或，所述加氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。8.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：周硕，劳淑华，雷军林，赖敦岳，陈振明，
申请(专利权)人：台州酶易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：