西他列汀中间体的制备方法技术

本申请公开了一种西他列汀中间体的制备方法，以及经由该制备方法制得的西他列汀中间体，所述制备方法包括：在一个标准大气压下沸点不高于110℃的有机溶剂存在的前提下，将转氨酶与底物西他列汀前体酮(2Z)

【技术实现步骤摘要】
西他列汀中间体的制备方法


[0001]本申请涉及酶工程及生物制药领域，具体涉及一种西他列汀中间体的制备方法。

技术介绍

[0002]西他列汀磷酸盐是一种治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，其活性成分为(3R)
‑3‑
氨基
‑1‑
[3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
1,2,4
‑
三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8H)
‑
基]‑4‑
(2,4,5
‑
三氟苯基)丁
‑1‑
酮(西他列汀,Sitagliptin)。西他列汀是一种二肽基肽酶
‑
4(DPP
‑
4)抑制剂，主要通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平，具有较好的安全性和耐受性。西他列汀制备工艺中的关键步骤为手性氨基中间体的合成。
[0003]在现有技术中，西他列汀的手性氨基中间体的合成方法主要有化学合成工艺和生物催化合成工艺，其中，化学合成工艺虽然工艺成熟，但是具有工艺步骤繁多、所用试剂(如金属催化剂等)昂贵、部分试剂(如金属催化剂等)对环境和人体具有毒害作用、合成的手性氨基中间体纯度较低等缺点。生物催化合成工艺是利用酶作为催化剂来制备西他列汀，其中所用的酶大多为转氨酶(Transaminase,TA)，生物催化合成工艺具有合成的手性氨基中间体立体选择性高、反应条件温和、对环境友好、纯化工序简单的优点。
[0004]目前公开的生物催化合成工艺仍具有一些不足之处，例如：由于底物水溶性差，所以需要在催化反应体系中加入有机溶剂以提高底物的溶解性，而有机溶剂的存在会加大后续产物分离纯化的难度。在专利申请WO2010099501中，采用生物催化合成工艺制备西他列汀的手性氨基中间体，在催化反应体系中添加了有机溶剂二甲基亚砜以提高底物的溶解性，由于二甲基亚砜沸点高，所以难以通过蒸馏的方式从反应产物中去除，使得反应产物在提纯过程中损失率较高，降低了产物的收率，导致制备成本的增加。因此，有必要对现有的生物催化合成工艺进行优化，以提供一种经济可靠、满足工业化生产需求的生物催化合成工艺来制备西他列汀的手性氨基中间体。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足之处，本申请提供了一种西他列汀中间体的制备方法，以改善现有生物催化合成工艺制备西他列汀中间体所存在的产物分离提纯难度高、产物收率低、生产成本高等问题。
[0006]第一方面，本申请提供了一种西他列汀中间体的制备方法，所述制备方法包括步骤：
[0007]将作为底物的西他列汀前体酮与在一个标准大气压下沸点不高于110℃的有机溶剂相混合，以获得混合液；以及
[0008]将所述混合液与转氨酶进行转氨接触以发生酶催化反应，生成西他列汀中间体；
[0009]其中，所述底物为式(Ⅰ)所示的化合物：
[0010][0011]所述西他列汀中间体为式(Ⅱ)所示的化合物：
[0012][0013]进一步地，所述将所述混合液与转氨酶进行转氨接触的方式为：将所述混合液以流加补料的方式加入至包含所述转氨酶的预混体系中。
[0014]进一步地，所述混合液中所述底物的浓度为10克每升(g/L)至500克每升(g/L)，流加速度为18毫升每小时(mL/h)至23毫升每小时(mL/h)，流加时间为14小时(h)至17小时(h)。
[0015]进一步地，在所述酶催化反应的反应体系中除了包括所述混合液和所述转氨酶，还包括异丙胺和磷酸吡哆醛，其中，磷酸吡哆醛用作辅酶，异丙胺用作辅底物。
[0016]进一步地，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二甲基亚砜、二氯甲烷以及甲苯中的至少一种。
[0017]进一步地，所述有机溶剂为甲醇。
[0018]进一步地，在所述酶催化反应的反应体系中除了包括所述混合液和所述转氨酶，还包括酮还原酶和辅酶再生系统，所述辅酶再生系统用于提供循环再生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
[0019]进一步地，所述辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，且所述转氨酶、所述葡萄糖脱氢酶和所述酮还原酶的质量比为6：(1～2)：(1～2)。
[0020]进一步地，所述酶催化反应的反应条件为pH为7.5至11.0，温度为15℃至65℃，转速为250转每分钟(r/min)至500转每分钟(r/min)。
[0021]进一步地，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与所述SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
[0022]其中，所述转氨酶的添加方式可以是：直接将所述转氨酶的纯酶液或包含所述转氨酶的酶制剂添加于预混体系中；或者，将含有所述转氨酶的编码基因的转化体经发酵培养后获得的湿菌体添加于预混体系中；或者，将所述湿菌体经破碎处理后的细胞破碎液添加于预混体系中；或者，将所述细胞破碎液经分离纯化处理后的产物添加于预混体系中。
[0023]有益效果：本申请提供了一种西他列汀中间体的制备方法，所述制备方法包括：在低沸点有机溶剂存在的情况下，将转氨酶与底物西他列汀前体酮(2Z)
‑4‑
氧代
‑4‑
[3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑7‑
(8H)
‑
基]‑1‑
(2,4,5
‑
三氟苯基)丁
‑2‑
酮转氨接触而发生酶催化反应，从而制得西他列汀中间体(3R)
‑3‑
氨基
‑1‑
[3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
1,2,4
‑
三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑7‑
基]‑4‑
(2,4,5
‑
三氟苯基)丁
‑1‑
酮，具有简化产物分离纯化工序、提高产物收率和有机溶剂回收率、降低生产成本的优点。
[0024]经实验发现，采用甲醇作为有机溶剂，并且将甲醇与底物相混合获得的混合液以流加补料的方式加入至包含所述转氨酶的预混体系中的技术手段有利于提高底物转化率，底物转化率可达97％。
[0025]经实验发现，采用甲醇作为有机溶剂，并且在包含所述转氨酶的预混体系中添加酮还原酶和辅酶再生系统，以使转氨酶、酮还原酶以及辅酶再生系统按照特定的比例复配的技术方案有利于提高底物转化率，底物转化率至少为97％。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种西他列汀中间体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将作为底物的西他列汀前体酮与在一个标准大气压下沸点不高于110℃的有机溶剂相混合，以获得混合液；以及将所述混合液与转氨酶进行转氨接触以发生酶催化反应，生成西他列汀中间体；其中，所述底物为式(Ⅰ)所示的化合物：所述西他列汀中间体为式(Ⅱ)所示的化合物：2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述混合液与转氨酶进行转氨接触的方式为：将所述混合液以流加补料的方式加入至包含所述转氨酶的预混体系中。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述混合液中所述底物的浓度为10克每升至500克每升，流加速度为18毫升每小时至23毫升每小时，流加时间为14小时至17小时。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述酶催化反应的反应体系中除了包括所述混合液和所述转氨酶，还包括异丙胺和磷酸吡哆醛。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二甲基亚砜、二氯甲烷以及甲苯中的至少一种。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：周硕，赖敦岳，叶涛，劳淑华，
申请(专利权)人：台州酶易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：