重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其在合成R‑3‑氨基丁酸中的应用，属于基因工程与生物合成技术领域。本发明专利技术的重组天冬氨酸酶突变体可以巴豆酸为底物，在催化R‑3‑氨基丁酸合成反应中的区域选择性以及立体选择性好；催化效率高，成本更低。利用本发明专利技术提供的利用重组天冬氨酸突变体合成R‑3‑氨基丁酸反应条件温和，对环境友好。

【技术实现步骤摘要】
重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用
本专利技术属于基因工程和生物合成
，尤其涉及重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用。
技术介绍
R-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyricacid)，CAS：3775-73-3，主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物。R-3-氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol)，CAS：61477-40-5，是一种用于治疗艾滋病药物度鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。因此，R-3-氨基丁酸是合成度鲁特韦的重要原料之一。R-3-氨基丁酸的合成路线开发具有重要的应用价值，开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本，推广其应用范围的关键步骤。但是，现有化学合成方法，反应条件苛刻，产率低，且容易产生废液废水，对环境不友好。亟需开发更加高效环保的R-3-氨基丁酸合成路线。
技术实现思路
为改善现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其在合成R-3-氨基丁酸中的应用。本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供一种重组天冬氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。本专利技术还涉及包含所述编码基因的表达盒、包含所述核酸或者表达盒的重组载体。进一步地，本专利技术还提供包含所述编码基因、表达盒或者所述载体的宿主细胞，例如用所述核酸序列、表达盒或者载体转化或转染原始宿主细胞。在一个实施方案中，所述表达盒包含表达所述变体的所有元件，包括在宿主细胞中转录和翻译过程中所必须的元件，例如，所述表达盒包括启动子和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现所述变体表达的启动子和终止子。例如，启动子可以是原核的或真核的，可选自例如Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等。本专利技术所述的表达盒，还可以任选地包括增强子或其他必须元件。在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或真核生物。真核生物可以是低等真核生物，诸如酵母(例如，巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)或真菌或高等真核生物诸如昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)等。所述宿主细胞优选大肠杆菌。在一些实施方案中，所述载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、病毒、YAC、BAC、土壤杆菌属(Agrobacterium)pTi质粒等。载体可以优选地包含选自以下的一个或更多个元件：复制起点、多克隆位点和可选择的基因。优选地，载体是质粒。所述载体的一些具体实例如下：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pBR322、pRIT5、pET-28a。优选地，所述载体是表达载体，优选为pET-28a。本专利技术提供了所述重组天冬氨酸酶突变体、其编码基因或宿主细胞在合成R-3-氨基丁酸中的应用。本专利技术提供了一种合成R-3-氨基丁酸的方法，包括将底物与上述重组天冬氨酸酶突变体接触，进行催化反应，生成R-3-氨基丁酸，其中，所述底物包括巴豆酸和氨水。在一些实施方案中，所述底物直接与经分离纯化的重组天冬氨酸酶突变体接触，进行催化反应。在一些实施方案中，所述催化反应的反应体系包括：浓度为50g/L-400g/L巴豆酸，浓度为10g/L-150g/L氨水，在重组天冬氨酸酶突变体作用下生产R-3-氨基丁酸。在一些实施方案中，所述催化反应的反应温度为15～60℃，所述催化反应的反应时间为8～60h。在一些实施方案中，所述反应的温度为30-45℃，所述反应的时间为10-24h，反应体系的pH为7.5-8.5。在一些实施方案中，所述PB缓冲液的浓度为0.01～0.5mol/L，所述PB缓冲液的pH为7.5-8.5。在一些实施方案中，所述重组天冬氨酸酶突变体的用量没有特别的限定，可以根据酶活力和催化速率的要求确定。在一些实施方案中，所述底物与表达重组天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，培养所述宿主细胞，进行催化反应。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的重组天冬氨酸酶突变体在催化R-3-氨基丁酸合成中的区域选择性以及立体选择性好；催化效率高，反应条件温和对环境友好，具有重大的经济和环境价值。附图说明图1为实施例5转化体系反应0小时取样液相图谱；图2为实施例5转化体系反应24小时取样液相图谱；图1和图2中，保留时间3分钟左右的峰为巴豆酸，6分钟左右的峰为R-3-氨基丁酸。具体实施方式本专利技术提供的重组天冬氨酸酶突变体，其重组氨基酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示。在本专利技术实施例中，所述重组载体以pET-28a(+)表达载体为初始载体，将所述重组天冬氨酸酶突变体的编码基因连接到所述pET-28a(+)表达载体上获得重组载体；在本专利技术实施例中，所述重组天冬氨酸酶突变体的编码基因优选的连接至XhoΙ和NdeΙ酶切位点之间。本专利技术对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域已知的重组载体制备方法。本专利技术提供了包括所述的重组天冬氨酸酶突变体的编码基因的重组菌株。在本专利技术中，所述重组菌株优选的通过将所述重组载体转入原始菌株中制备获得重组菌株。在本专利技术中，所述原始菌株优选为大肠杆菌JM109(DE3)。本专利技术对所述重组菌株的制备方法没有特殊要求，可以采用本领域已知的重组菌株制备方法。如无特殊说明，本专利技术所用试剂均为市购所得。下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1生产野生型天冬氨酸酶LBS合成的基因LBS连接到表达载体pET-28a(+)上，使其可以在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。实验操作流程如下：a)使用相同的限制性内切酶对编码SEQIDNo.1氨基酸序列的核苷酸序列SEQIDNo.4和表达载体pET-28a(+)进行双酶切以得到粘性末端片段，37℃酶切100min后与10X的LoadingBuffer，吹打均匀后进行琼脂糖凝胶电泳，20μL的酶切体系见表1。表1限制性内切酶酶切体系b)使用DNA胶回收试剂盒纯化回收LBS基因片段和pET-28a(+)载体片段，具体操作步骤见说明书；c)使用Ligationhigh(购自东洋纺生物科技有限公司)将回收产物连接成环形质粒，16℃连接3h，连接体系见表2。表2粘性末端片段的连接体系d)12μL的连接产物转化至大肠杆菌JM109(DE3)，活化抗性菌后提取pET-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。


2.编码如权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示。


3.包括如权利要求2所述基因的表达盒或重组载体。


4.包括如权利要求3所述基因的表达盒或重组载体的宿主细胞。


5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。


6.如权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体在合成R-3-氨基丁酸中的应用。


7.一种合成R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括将底物与权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖敦岳，周硕，叶涛，雷军林，张壹腾，汪钱，
申请(专利权)人：台州酶易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33