醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(S)-TCPE中的应用制造技术

本发明专利技术提供了醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(S)‑TCPE中的应用，属于生物合成技术领域，所述醛酮还原酶突变体，将野生型的AKRED‑Lk中以下位点中的一个或几个进行突变：将A94突变为S94；将E145突变为A145、L145或C145；将S96突变为E96。所述醛酮还原酶突变体在合成中的区域选择性以及立体选择性好；同时催化效率更高，成本更低。利用本发明专利技术提供的利用醛酮还原酶突变体合成(S)‑TCPE反应条件温和，对环境友好；使用异丙醇，实现了辅酶的循环利用，进一步降低生产成本。

Aldosterone reductase mutants, coding genes and their application in the synthesis of (s) - tcpe

【技术实现步骤摘要】
醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(S)-TCPE中的应用
本专利技术属于生物合成
，尤其涉及醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(S)-TCPE中的应用。
技术介绍
卢立康唑是一种新型咪唑类抗真菌剂，通过抑制真菌细胞中的甾醇14α-脱甲基酶从而干扰麦角甾醇的生物合成，同时卢立康唑显示出广谱性的抗真菌活性。作为手性来源，(S)-TCPE是卢立康唑最关键的中间体。然而，已有的(S)-TCPE化学合成路线效率低，反应条件苛刻，并需要昂贵的起始手性材料，并不利于工业化生产。醛酮还原酶(AKRED)，具有不对称催化含羰基(或醛基)有机物(如芳基酮、脂肪酮和各种醛有机物)得到相应的手性醇的能力，是生物催化中最常用的酶种之一。但是当前开发的AKRED种类很大程度上满足不了当今的醛酮底物的还原氧化反应，尤其是高立体选择性和区域选择性的AKRED的开发，广底物谱的AKRED也还有待进一步开发；其次，AKRED的催化活性比较低，活性低带来催化目标底物浓度较低、所需的反应周期长，设备占用周期长，时空产率较低，应用于工业生产的AKRED还有待进一步开发。目前，尚未有相关文献报道应用醛酮还原酶制备(S)-TCPE。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(S)-TCPE中的应用；所述醛酮还原酶突变体在合成中的区域选择性以及立体选择性好；同时催化效率更高，成本更低。利用本专利技术提供的利用醛酮还原酶突变体合成(S)-TCPE反应条件温和，对环境友好；在醛酮酶反应中，需要用到辅酶，而辅酶十分昂贵；本专利技术提供的利用醛酮还原酶突变体合成(S)-TCPE的方法中，使用异丙醇，实现了辅酶的循环利用，进一步降低生产成本。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种醛酮还原酶突变体，将野生型的AKRED-Lk中以下位点中的一个或几个进行突变：将A94突变为S94；将E145突变为A145、L145或C145；将S96突变为E96。优选的，所述醛酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了所述的醛酮还原酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术提供了包括所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组载体。本专利技术提供了包括所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组菌株。本专利技术提供了所述的醛酮还原酶突变体在合成(S)-TCPE中的应用。本专利技术提供了一种利用所述的醛酮还原酶突变体在合成(S)-TCPE的方法，包括以下步骤：将反应原料混合获得合成体系；将所述合成体系置于28～32℃反应8～12h；所述合成体系如下：优选的，所述合成体系如下：优选的，所述反应的温度为30℃，所述反应的时间为10h。优选的，所述PB缓冲液的浓度为0.08～0.12mol/L，所述PB缓冲液的pH为7.4～7.6。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的醛酮还原酶突变体，通过将氨基酸A94、S96和E145中的一个或几个位点进行突变获得，所述醛酮还原酶突变体在合成中的区域选择性以及立体选择性好；同时催化效率更高，成本更低。利用本专利技术提供的利用醛酮还原酶突变体合成(S)-TCPE反应条件温和，对环境友好；在醛酮酶反应中，需要用到辅酶，而辅酶十分昂贵；本专利技术提供的利用醛酮还原酶突变体合成(S)-TCPE的方法中，使用异丙醇，实现了辅酶的循环利用，进一步降低生产成本。进一步的，三突变的醛酮还原酶突变体的酶活力较单突变酶活力提高6倍左右，具有良好的工业应用前景。附图说明图1为AKRED-Lk与TCAP、NADPH的三元复合物的稳定结合构象；图2为AKRED-Lk-NADPH-TCAP三元复合物稳定构象；图3为pET-28a-AKRED-Lk双酶切验证电泳图；图4为野生型及各突变体蛋白纯化图；图5为KRED-Lk的A94位点突变体对TCAP的活性结果；图6为KRED-Lk-S的E145位点突变体对TCAP的活性结果；图7为KRED-Lk-SA的S96位点突变体对TCAP的活性结果。具体实施方式本专利技术提供了一种醛酮还原酶突变体，将野生型的AKRED-Lk中以下位点中的一个或几个进行突变：将A94突变为S94；将E145突变为A145、L145或C145；将S96突变为E96。在本专利技术中，所述野生型的AKRED-Lk是来源于乳酸杆菌(LactobacilluskefiriDSM20587)；所述野生型AKRED-Lk的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述野生型AKRED-Lk的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术中，所述野生型AKRED-Lk对于底物TCAP几乎没有任何活性。在本专利技术中，将野生型的AKRED-Lk中的A94突变为S94，即将第94位的丙氨酸突变为丝氨酸后，对底物TCAP的活力大幅提高。在本专利技术中，野生型的AKRED-Lk中的A94突变为S94后的突变体氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，所述A94突变为S94后的突变体的编码基因如SEQIDNo.4所示。在本专利技术中，可选的将野生型的AKRED-Lk中的E145位点的突变，将E突变为丙氨酸、亮氨酸以及半胱氨酸时，对底物的活力均有明显提高，其中突变为丙氨酸时，活力最高。在本专利技术中，将E145突变为A145后的突变体氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述将E145突变为A145后的突变体的编码基因如SEQIDNo.6所示。在本专利技术中，可选的将野生型的AKRED-Lk中的将S96突变为E96后，对底物的活力有明显提高。在本专利技术中，优选的将野生型的AKRED-Lk中的A94突变为S94，将E145突变为A145，并将S96突变为E96获得最优的醛酮还原酶突变体AKRED-Lk-SAE，所述醛酮还原酶突变体AKRED-Lk-SAE的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。本专利技术提供了所述的醛酮还原酶突变体AKRED-Lk-SAE的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。本专利技术对上述述醛酮还原酶突变体AKRED-Lk-SAE的编码基因的制备方法没有特殊限定，采用人工合成即可。本专利技术提供了包括所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组载体。在本专利技术中，所述重组载体以pET-28a(+)表达载体为初始载体，将所述醛酮还原酶突变体的编码基因连接到所述pET-28a(+)表达载体上获得重组载体；在本专利技术中，所述醛酮还原酶突变体的编码基因优选的连接至XhoΙ和NdeΙ酶切位点之间。本专利技术对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体制备方法即可。本专利技术提供了包括所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组菌株。在本专利技术中，所述重组菌株优选的通过将所述重组载体转入原始菌株中制备获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于，将野生型的AKRED-Lk的氨基酸序列中以下位点中的一个或几个进行突变：/n将A94突变为S94；/n将E145突变为A145、L145或C145；/n将S96突变为E96。/n

【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于，将野生型的AKRED-Lk的氨基酸序列中以下位点中的一个或几个进行突变：
将A94突变为S94；
将E145突变为A145、L145或C145；
将S96突变为E96。


2.根据权利要求1所述的醛酮还原酶突变体，其特征在于，所述醛酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.权利要求2所述的醛酮还原酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.包括权利要求3所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组载体。


5.包括权利要求3所述的醛酮还原酶突变体的编码基因的重组菌株。


6.权利要求1或2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周硕，赖敦岳，汪钱，何龙丹，叶涛，劳淑华，
申请(专利权)人：台州酶易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33