一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物法生产L

【技术实现步骤摘要】
一种生物法生产L
‑5‑
甲基四氢叶酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种生产L
‑5‑
甲基四氢叶酸(L
‑5‑
MTHF)的方法，尤其涉及一种利用构建大肠杆菌工程菌生物法生产L
‑5‑
MTHF的方法，属于生物


技术介绍

[0002]L
‑5‑
甲基四氢叶酸(L
‑5‑
MTHF)，是维生素B9的生物活性形式，可直接被人体吸收参与体内的甲基化过程和DNA合成，对许多疾病都有一定的治疗作用，如巨红细胞贫血症、神经管缺陷和癌症等，在维持人体健康方面具有重要作用。作为叶酸类药物中唯一可以透过血脑屏障的物质，L
‑5‑
MTHF可以用来预防阿尔兹海默症，另外，人体中亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变会影响体内L
‑5‑
MTHF的合成，也会引发人体的一系列疾病，因此，对于亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变的人群来说，直接服用L
‑5‑
MTHF类药物是十分必要的。欧盟委员会于2014年3月19日决定将L
‑5‑
MTHF作为一种新型食品添加剂，增加了L
‑5‑
MTHF的市场需求量，这迫使需不断的更新技术以获得更大量的L
‑5‑
MTHF。
[0003]在已有的文献报道中，大部分5
‑
MTHF都是经化学法合成的，以叶酸为原料，先还原为四氢叶酸，后经甲基化和进一步还原生成5
‑
MTHF。但化学合成需要大量的强化学还原剂，具有一定的危险性，且合成的5
‑
MTHF是外消旋混合物，需要通过手性拆分获得具有生物活性的L
‑5‑
MTHF。此外，化学法合成5
‑
MTHF产率小，纯度低，污染环境，不利于人体健康。
[0004]经检索，有关对Escherichia coli进行代谢改造，在其细胞中构建新的合成L
‑5‑
MTHF代谢途径，且阻断L
‑5‑
MTHF的分解代谢途径，并进一步通过优化发酵条件的生物法合成L
‑5‑
MTHF的方法还未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用大肠杆菌工程菌生物法生产L
‑5‑
甲基四氢叶酸(L
‑5‑
MTHF)的方法。
[0006]本专利技术所述的生物法生产L
‑5‑
MTHF的方法，步骤是：
[0007](1)构建产L
‑5‑
MTHF的工程菌：
[0008]a.以Escherichia.coli BL21(DE3)基因组为模板扩增SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF，将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet
‑
1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet
‑
metF
‑
folA；以Clostridium autoethanogenum基因组为模板扩增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fhs
‑
fchA
‑
folD，将fhs
‑
fchA
‑
folD基因克隆到pETDuet
‑
1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet
‑
WL；以Methylobacterium extorquens AM1基因组作为模板扩增SEQ ID NO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fchA
‑
mtdA，将ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet
‑
1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet
‑
C1T；
[0009]b.将质粒pACYCDuet
‑
metF
‑
folA和pETDuet
‑
WL共同转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L
‑5‑
MTHF的工程菌，命名为BL21
‑
WL；将质粒pACYCDuet
‑
metF
‑
folA和pETDuet
‑
C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因(metH)的E.coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L
‑5‑
MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)
‑
C1T；
[0010](2)产L
‑5‑
MTHF的工程菌发酵：
[0011]将产L
‑5‑
MTHF的工程菌BL21
‑
WL菌株或BL21(ΔmetH)
‑
C1T菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，在37
±
1℃和180～220rpm转速条件下培养2～4小时至OD
600nm
为0.6～1.0，获得菌液；向制得的菌液中加入终浓度为0.4～0.8mM的IPTG，在20～37℃、100～120rpm转速下诱导8～16小时，然后将培养液离心收集菌体，即获得含L
‑5‑
MTHF的工程菌细胞；
[0012]其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨10～15g
·
L
‑1，酵母粉20～30g
·
L
‑1，甘油2～5ml
·
L
‑1，叶酸0.01～0.4g
·
L
‑1，甲酸钠0.1～4.0g
·
L
‑1，KH2PO
4 2～4g
·
L
‑1，K2HPO
4 12～14g
·
L
‑1；氨苄青霉素终浓度为50μg
·
ml
‑1，氯霉素的终浓度为25μg
·
ml
‑1；
[0013](3)破碎工程菌细胞，释放出L
‑5‑
MTHF：
[0014]将离心后获得的工程菌细胞在厌氧箱中用含0.1％的抗坏血酸和含0.1％巯基乙醇的50mM pH 7.2的经煮沸后脱气厌氧处理的Tris
‑
HCl溶液重悬，密封在厌氧小瓶中，100℃水浴煮沸10min破碎细胞，即得含L
‑5‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物法生产L
‑5‑
甲基四氢叶酸的方法，步骤是：(1)构建产L
‑5‑
甲基四氢叶酸(L
‑5‑
MTHF)的工程菌：a.以E.coli BL21(DE3)基因组为模板扩增SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF，将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet
‑
1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet
‑
metF
‑
folA；以C.autoethanogenum基因组为模板扩增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fhs
‑
fchA
‑
folD，将fhs
‑
fchA
‑
folD基因克隆到pETDuet
‑
1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet
‑
WL；以M.extorquens AM1基因组作为模板扩增SEQ ID NO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fchA
‑
mtdA，将ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet
‑
1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet
‑
C1T；b.将质粒pACYCDuet
‑
metF
‑
folA和pETDuet
‑
WL共同转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L
‑5‑
MTHF的工程菌，命名为BL21
‑
WL；将质粒pACYCDuet
‑
metF
‑
folA和pETDuet
‑
C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因(metH)的E.coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L
‑5‑
MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)
‑
C1T；(2)产L
‑5‑
MTHF的工程菌发酵：将产L
‑5‑
MTHF的工程菌BL21
‑
WL菌株或BL21(ΔmetH)
‑
C1T菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，在37
±
1℃和180～220rpm转速条件下培养2～4小时至OD
600nm
为0.6～1.0，获得菌液；向制得的菌液中加入终浓度为0.4～0.8mM的IPTG，在20～37℃、100～120rpm转速下诱导8～16小时，然后将培养液离心收集菌体，即获得含L
‑5‑
MTHF的工程菌细胞；其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨10～15g
·
L
‑1，酵母粉20～30g
·
L
‑1，甘油2～5ml
·
L
‑1，叶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王书宁，王煜博，张萌，梁继禹，伊继洪，许平，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：