一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用，即提供了一种以葡萄糖为底物的来源于氧和葡萄球菌的葡萄糖脱氢酶突变体，该突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第259位的天冬氨酸突变成半胱氨酸，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比具有更高的热稳定性，野生型Tm值为64℃、突变体Tm值为73℃，较野生型增加了近10℃，且突变体的产量也比野生型高出2倍。此外，本发明专利技术还提供了该酶的蛋白质晶体，为进一步改造高活性、高稳定性的葡萄糖脱氢酶提供了研究基础。高稳定性的葡萄糖脱氢酶提供了研究基础。高稳定性的葡萄糖脱氢酶提供了研究基础。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。

技术介绍

[0002]氧化还原酶可以分为氢酶、氧化酶、还原酶、过氧化物酶、加氧酶、过氧化氢酶和羟化酶等。这些酶在发挥催化活性时都需要其辅因子如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP)、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、吡咯并喹啉醌(PQQ)或者辅酶Q(CoQ)的参与。NAD(P)H作为一种常见的辅助因子，广泛应用于大多数的酶催化氧化还原反应和生物燃料电池中。内源性NAD(P)H是通过生物体内的初级代谢产生的。外源性NAD(P)H的供应因为成本高、稳定性低的特点而面临挑战；
[0003]近年来，一些化学、光化学、酶催化和电化学NAD(P)H再生系统在解决外源NAD(P)H再生体系中起到了一些作用。其中，酶催化法因其反应速度快、选择性好、再生体系与合成体系具有较好的相容性而受到越来越多的关注。大多数NAD(P)H再生体系都是以一些价格便宜的原料为底物如单糖、乙醇等，其中单糖中因葡萄糖价格低，通常使用最多。
[0004]NAD(P)依赖的葡萄糖脱氢酶以NAD+或NADP+为辅因子，产生D
‑
葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯和NAD(P)H，已广泛用于NAD(P)H再生的许多氧化还原反应中，在工业生物催化制药前体的合成方面具有巨大的应用潜力。一般而言，当辅酶特异性逆转时，酶的催化活性就会降低。一些研究结果表明，当辅酶从NAD切换到NADP时，得到了更好的效果。此外，通过对比NAD+和NADH、NADP+和NADPH之间的价格可知，NADH是NAD+价格的3倍，而NADPH是NADP+价格的7倍左右，这表明在工业生物催化制药过程中寻找具有生产高活性的以NADP+作为辅因子的催化酶对于加速NADPH特异性的生物催化过程至关重要。因此，本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术的首要目的在于提供一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。
[0006]本专利技术的具体技术方案包括：
[0007]本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体是通过将葡萄糖脱氢酶(以下简称野生型GOX2015)的蛋白序列的第259位的天冬氨酸突变成半胱氨酸后得到的，该葡萄糖脱氢酶突变体(以下简称GOX2015突变体)的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为本专利技术的进一步优化方案，所述GOX2015突变体的表达载体为pET
‑
28a，表达GOX2015突变体的菌株为大肠杆菌BL21。
[0009]作为本专利技术的进一步优化方案，所述GOX2015突变体的编码基因如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术还提供了一种如上述GOX2015突变体在氧化还原反应中辅酶NADH及NADPH再生中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种基于上述GOX2015突变体的蛋白质晶体，所述蛋白质晶体是将纯化得到的GOX2015突变体采用坐滴法进行结晶后得到的。
[0012]作为本专利技术的进一步优化方案，所述蛋白质晶体的出晶条件为0.1M氯化镁、0.1M柠檬酸三钠,pH 5.0及15％PEG4000。
[0013]本专利技术还提供了一种如上述蛋白质晶体在改造高活性高稳定性的葡萄糖脱氢酶中的应用。
[0014]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0015]本专利技术提供了一种以葡萄糖为底物的来源于氧和葡萄球菌的葡萄糖脱氢酶突变体，该突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第259位的天冬氨酸突变成半胱氨酸，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比具有更高的热稳定性，野生型Tm值为64℃、突变体Tm值为73℃，较野生型增加了近10℃，具有与嗜热菌相似的Tm值，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。此外，该突变体的产量也比野生型高出2倍；
[0016]此外，本专利技术提供的葡萄糖脱氢酶还具有氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生中的应用，其还原NADP+活性比其他已报道的葡萄糖脱氢酶要高3.5倍，更适合NADPH再生中的应用，为工业生物催化制药过程NADPH的再生提供了更好的催化酶；
[0017]最后，本专利技术还提供了该酶的蛋白质晶体，为进一步改造高活性、高稳定性的酶提供了研究基础。
附图说明
[0018]图1为野生型GOX2015及GOX2015突变体蛋白小量表达SDS
‑
PAGE检测结果；
[0019]图2为野生型GOX2015及GOX2015突变体蛋白亲和纯化结果；
[0020]图3为野生型GOX2015的蛋白质量检测结果；
[0021]图4为GOX2015突变体的蛋白质量检测结果；
[0022]图5为GOX2015及GOX2015突变体热稳定性检测结果；
[0023]图6为GOX2015突变体和GDH再生NADPH活性检测结果；
[0024]图7为GOX2015突变体蛋白质晶体照片。
具体实施方式
[0025]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
[0026]一、材料
[0027]本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0028]二、方法
[0029]1、重组质粒的构建及表达
[0030](1)野生型GOX2015及GOX2015突变体的基因序列均是通过基因合成获得，分别在N
端带有6His和StrepⅡ融合标签，表达载体为pET
‑
28a，重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致，GOX2015突变体是在野生型GOX2015的原始序列基础上将259位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，GOX2015突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。将野生型GOX2015和GOX2015突变体两种类型的重组质粒分别按照常规分子生物学手段分别转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌斑至5mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600至0.6
‑
0.8时取少量菌液用loading buffer进行固定，并取少量菌液加入甘油冻至
‑
80℃，剩余菌液加入0.5mM IPTG诱导4个小时后，收集菌体并取诱导后菌液进行SDS
‑
PAGE检测。根据SDS
‑
PAGE结果可知，野生型GOX2015和GOX2015突变体在BL21(DE3)大本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，表达所述葡萄糖脱氢酶突变体的载体为pET
‑
28a，表达葡萄糖脱氢酶突变体的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。3.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的编码基因如SEQ ID NO.2所示。4.一种如权利要求1
‑
3任一所述的葡萄糖脱氢酶突变体在氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，王俊超，桂文君，成望，吕志佳，
申请(专利权)人：无锡佰翱得生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：