一种咖啡酸-生物素小分子探针的设计及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种咖啡酸

【技术实现步骤摘要】
一种咖啡酸
‑
生物素小分子探针的设计及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种咖啡酸
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生物素小分子探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物，具有良好的抗氧化活性，作为天然抗氧化剂在肉制品中的应用日益广泛。然而，研究发现多酚在肉制品中存在“促氧化”的现象，即邻苯二酚类植物多酚在清除自由基过程中自身氧化形成半醌，与蛋白质侧链中活性基团(SH，NH2)发生迈克尔加成反应，形成多酚
‑
蛋白加合物。这种加合物可能对蛋白质营养价值和消化吸收效率产生重要影响，目前对其生物活性及安全性尚未深入研究。
[0003]综上所述，植物多酚作为天然抗氧化剂，在应用过程中发生迈克尔加成反应，无法通过有效手段准确检测，导致目前关于多酚与蛋白加成机制研究较少，多酚
‑
蛋白加合物在肉中形成机制尚不清晰、对食品品质和人体营养与健康影响尚未深入研究。这可能阻碍植物多酚的深入应用，甚至存在潜在的安全风险。
[0004]因此，设计与合成一种由植物多酚出发合成，得到仍然具备咖啡酸本身的生物活性的植物多酚小分子探针，进而以植物多酚小分子探针替代植物多酚与蛋白质反应，实现对多酚
‑
蛋白加合物的检测，将对植物多酚与蛋白相互作用机制的研究具有重要意义。食品领域尚无使用分子探针来研究多酚
‑
蛋白相互作用。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术提供一种咖啡酸
‑
生物素小分子探针及其制备方法和应用，以克服现有多酚
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蛋白作用机制研究的不足。本专利技术选用邻苯二酚类植物多酚——咖啡酸(CFA)，采用生物素作为标记基团，将生物素与咖啡酸连接形成“生物素
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咖啡酸”小分子探针，从而钓取其作用位点。本专利技术首次合成、使用多酚小分子探针并借助SDS
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PAGE鉴定多酚结合蛋白，即多酚
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蛋白加合物。
[0006]本专利技术的第一个问题是提供一种咖啡酸
‑
生物素小分子探针，所述小分子探针的结构如式Ⅰ所示，
[0007][0008]本专利技术的第二个问题是提供一种制备前述的咖啡酸
‑
生物素小分子探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]S1：生物素
‑
连接链部分的合成：
[0010]S1
‑
1：化合物1经取代、硝化、还原反应，得中间体5；
[0011]所述化合物1为
[0012]中间体5为
[0013]S1
‑
2：化合物6经酰胺化、加成反应，得中间体8；
[0014]所述化合物6为
[0015]中间体8为
[0016]S1
‑
3：将中间体5、中间体8、三乙胺和六氟磷酸盐按1:0.5～1:0.5～1:1～1.5的质量之比溶于有机溶剂A中，室温下搅拌反应10～20h，然后避光静置、过滤、烘干，得中间体9，即生物素
‑
连接链部分；
[0017]所述中间体9为
[0018]S2：咖啡酸酚羟基的保护：
[0019]S2
‑
1：化合物10经酯化，得中间体11；
[0020]所述化合物10为
[0021]中间体11为
[0022]S2
‑
2：将中间体11和三乙胺按1:2～2.5的质量之比溶于有机溶剂B中，加入甲基甲醚，室温下搅拌过夜，经过滤、旋干，得中间体12；
[0023]所述中间体12为
[0024]S2
‑
3：将中间体12溶于有机溶剂C中，加入碱，室温搅拌过夜，经萃取、干燥，得中间
体13，即酚羟基受到保护的咖啡酸；
[0025]所述中间体13为
[0026]S3：咖啡酸
‑
生物素小分子探针的合成：
[0027]将S1得到的中间体9、S2得到的中间体13、4
‑
N,N
‑
二甲氨基吡啶、盐酸盐按1:0.1～0.5:0.1～0.3:0.5～1的质量之比溶于有机溶剂D中，室温搅拌过夜，经打浆、旋干，得式Ⅰ所示化合物，即咖啡酸
‑
生物素小分子探针。
[0028]本专利技术所述制备方法的S1和S2的操作顺序没有特殊限定，S1和S2可以同步进行，或先进行S1后进行S2，或先进性S2后进行S1。
[0029]进一步的，S1
‑
3中所述中间体5、中间体8、三乙胺和六氟磷酸盐按1:0.9:0.9:1.4的质量之比溶于有机溶剂A中。
[0030]进一步的，S1所述有机溶剂A为四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、N，N
‑
二甲基乙酰胺、丙酮中的一种。
[0031]中间体8在有机溶剂A中的浓度为12～16mL/g，优选14～15mL/g。
[0032]进一步，S2
‑
2中所述中间体11和三乙胺按1:2的质量之比溶于有机溶剂B中；
[0033]进一步的，S2所述有机溶剂B为四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、N，N
‑
二甲基乙酰胺、丙酮、二氯甲烷、1，2
‑
二氯乙烷、氯仿中的一种；
[0034]中间体11在有机溶剂B中的浓度为8～12mL/g，优选10～11mL/g。
[0035]所述有机溶剂C为四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、二氯甲烷、1，2
‑
二氯乙烷、氯仿、甲基亚砜中的一种；
[0036]中间体12在有机溶剂C中的浓度为5～10mL/g，优选7～9mL/g。
[0037]所述碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的一种；
[0038]优选的，碱为浓度为1mol/L的碱溶液，碱溶液与有机溶剂C的体积之比为2～3:1，优选2～2.1:1。
[0039]进一步，中间体9、中间体13、4
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N,N
‑
二甲氨基吡啶、EDC盐酸盐按1:0.5:0.2:0.7的质量之比溶于有机溶剂D中；
[0040]进一步的，有机溶剂D为四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、N，N
‑
二甲基乙酰胺、丙酮中的一种或几种。
[0041]中间体9在有机溶剂D中的浓度为10～20mL/g，优选16～18mL/g。
[0042]本专利技术的第三个目的是提供前述的咖啡酸
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生物素小分子探针在定性和/或定量检测多酚
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蛋白加合物中的应用。
[0043]所述应用步骤为：将咖啡酸
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种咖啡酸
‑
生物素小分子探针，其特征在于，所述小分子探针的结构如式Ⅰ所示，2.一种制备权利要求1所述的咖啡酸
‑
生物素小分子探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：生物素
‑
连接链部分的合成：S1
‑
1：化合物1经取代、硝化、还原反应，得中间体5；所述化合物1为中间体5为S1
‑
2：化合物6经酰胺化、加成反应，得中间体8；所述化合物6为中间体8为S1
‑
3：将中间体5、中间体8、三乙胺和六氟磷酸盐按1:0.5～1:0.5～1:1～1.5的质量之比溶于有机溶剂A中，室温下搅拌反应10～20h，然后避光静置、过滤、烘干，得中间体9，即生物素
‑
连接链部分；所述中间体9为S2：咖啡酸酚羟基的保护：S2
‑
1：化合物10经酯化，得中间体11；所述化合物10为
中间体11为S2
‑
2：将中间体11和三乙胺按1:2～2.5的质量之比溶于有机溶剂B中，加入甲基甲醚，室温下搅拌过夜，经过滤、旋干，得中间体12；所述中间体12为S2
‑
3：将中间体12溶于有机溶剂C中，加入碱，室温搅拌过夜，经萃取、干燥，得中间体13，即酚羟基受到保护的咖啡酸；所述中间体13为S3：咖啡酸
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生物素小分子探针的合成：将S1得到的中间体9、S2得到的中间体13、4
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N,N
‑
二甲氨基吡啶、盐酸盐按1:0.1～0.5:0.1～0.3:0.5～1的质量之比溶于有机溶剂D中，室温搅拌过夜，经打浆、旋干，得式Ⅰ所示化合物，即咖啡酸
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生物素小分子探针。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：S1所述有机溶剂A为四氢呋喃、2
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甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、N，N
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二甲基乙酰胺、丙酮中的一种；中间体8在有机溶剂A中的浓度为12～16mL/g，优选14～15mL/g。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：S2所述有机溶剂B为四氢呋喃、2
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甲基四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、N，N
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二甲基乙酰胺、丙酮、二氯甲烷、1，2
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二氯乙烷、氯仿...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐长波，杨粉红，周光宏，靳爽爽，郭赟，王嘉栎，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：