一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用，涉及小分子羧酸化合物甲酯化、生物工程和酶催化领域，其氨基酸序列为如序列表SEQIDNO:1～SEQIDNO:7中任一所示；该甲基转移酶的表达载体，包含编码甲基转移酶的核酸序列，表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；包含该表达载体的工程菌；将甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物的应用；该工程菌在转化羧酸化合物生成甲酯化产物的应用。本发明专利技术提供了一种小分子羧酸甲酯化工艺，该工艺绿色高效，价格低廉，适用性宽泛，能够实现多种小分子羧酸的甲酯化，具有极大的应用潜力及经济价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶及其应用


[0001]本专利技术涉及小分子羧酸化合物甲酯化、生物工程和酶催化领域，具体涉及一种羧基甲基转移酶、表达载体和工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]小分子羧酸化合物甲酯化是一种重要的反应类型，在医药、化工、能源等领域都有重要的应用。常见的工业化羧酸甲酯化的化学合成工艺主要分为两类：一类为以较惰性的甲醇作为甲酯化试剂，该合成过程往往需要以酸、碱或无机盐等作为催化剂，通常面临设备易被腐蚀，催化剂难以回/收，反应时间长，甲醇用量大等问题；另一类为以较活泼的碘甲烷、重氮甲烷等作为甲酯化试剂，这些活泼的甲酯化试剂较为昂贵，且通常具有较强的毒性，甚至具有易爆等危险特点。
[0003]以广泛应用于香料制作的肉桂酸甲酯的制备为例，传统的合成工艺以甲醇和肉桂酸做底物，以浓硫酸作为催化剂来制备肉桂酸甲酯，设备老化快，催化剂以及反应溶剂均回收困难，虽然后续有部分专利研究利用三氯化铁等提高肉桂酸甲酯的转化率，但甲醇用量十分大，原料不经济。因此，发展绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸的甲酯化工艺，是科学研究者们不断追求的目标，也是市场的迫切需求。
[0004]相比于化学合成，生物催化反应条件温和，对环境更加友好。迄今为止，研究者们也陆续发现了一些羧基甲基转移酶，可以催化部分小分子羧酸甲酯化，这些酶主要来源于植物，氨基酸序列同源性很高，被统称为SABATH家族。然而，这些羧基甲基转移酶对底物识别十分单一，效率也不高，至今仍未用于工业化生产。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸甲酯化方法，以及能够实现多种小分子羧酸的甲酯化的甲基转移酶。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种绿色高效，价格低廉，适用性宽泛的小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶，并应用于多种小分子羧酸的甲酯化。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶，其氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示。
[0008]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有30％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0009]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有35％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0010]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有40％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0011]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列
具有65％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0012]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0013]进一步地，上述甲基转移酶还包括与与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。
[0014]进一步地，甲基转移酶的核酸序列为如序列表SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14中任一所示；或者经密码子优化过的可以编码如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示的氨基酸序列的核酸序列；或者在严格条件下与如序列表SEQ ID NO:8～NO:14中任一所示的核酸分子杂交且编码如序列表SEQ ID NO:1～NO:7中任一所示的氨基酸序列的核酸序列。
[0015]进一步地，氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5的甲基转移酶来自小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)，氨基酸序列为SEQ ID NO:6的甲基转移酶来自麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)，氨基酸序列为SEQ ID NO:7的甲基转移酶来自结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)，这些酶具有类似底物识别规律，均可催化多种不同骨架类型的小分子羧酸甲酯化，这些酶的氨基酸序列最低同源性为30％，这些酶催化功能的发现为其产业化应用奠定了基础。
[0016]进一步的核酸序列SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:12来自小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054)，核酸序列为SEQ ID NO:13来自麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)，核酸序列为SEQ ID NO:14来自结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)。
[0017]本专利技术还提供了一种甲基转移酶的表达载体，包含编码甲基转移酶的核酸序列，表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；原核表达载体包括大肠杆菌表达载体pET系列。
[0018]本专利技术还提供了一种包含甲基转移酶的表达载体的工程菌，工程菌为重组微生物或基因改造微生物，重组微生物是通过将甲基转移酶的核酸序列的表达载体导入原核微生物或真核微生物体内所得到的；基因改造微生物为将含有编码甲基转移酶核酸序列的天然微生物通过基因工程改造后用于催化小分子羧酸化合物发生甲酯化的微生物；基因工程包括基因敲除或中断。
[0019]进一步地，重组微生物为将可编码甲基转移酶pET重组质粒导入异源宿主大肠杆菌中，获得具有催化小分子羧酸甲酯化功能的工程菌，为其他异源表达工程菌株的构建提供了参考。
[0020]进一步地，基因改造的微生物为通过基因工程技术将分支杆菌(Mycobacterium neoaurum CCTCC AB2019054))的部分基因进行中断或过表达，获得可以催化小分子羧酸甲酯化，并能积累甲酯化产物的工程菌。
[0021]进一步地，原核微生物包括大肠杆菌、假单胞菌或分枝杆菌，真核微生物包括酵母菌或丝状真菌。
[0022]本专利技术还提供了一种甲基转移酶的应用，将甲基转移酶用于催化小分子羧酸化合物的羧基发生甲基化，生成甲酯化产物。
[0023]进一步地，从工程菌中提取具有催化羧酸发生甲酯化的酶活性物质，然后以粗酶
液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化羧酸底物生成甲酯化产物。
[0024]进一步地，甲基转移酶催化小分子羧酸发生甲酯化的应用，需要在S
‑
腺苷
‑
L
‑
蛋氨酸(SAM)存在的情况下，以pH为6～8的缓冲液为反应溶液。
[0025]进一步地，小分子羧酸化合物为化合物Ia、IIa、IIIa、Ⅳa或
Ⅴ
a，其结构通式如下所示：
[0026][0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化小分子羧酸甲酯化的甲基转移酶，其特征在于，所述甲基转移酶的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示。2.如权利要求1所述的甲基转移酶，其特征在于，所述甲基转移酶还包括与所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有30％以上同源性且具有相同功能的所述氨基酸序列。3.如权利要求1所述的甲基转移酶，其特征在于，所述甲基转移酶的核酸序列为如序列表SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14中任一所示；或者经密码子优化过的可以编码所述如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7中任一所示的所述氨基酸序列的所述核酸序列；或者在严格条件下与所述如序列表SEQ ID NO:8～NO:14中任一所示的核酸分子杂交且编码所述如序列表SEQ ID NO:1～NO:7中任一所示的所述氨基酸序列的所述核酸序列。4.一种权利要求1
‑
3任一所述的甲基转移酶的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含编码所述甲基转移酶的核酸序列，所述表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；所述原核表达载体包括大肠杆菌表达载体pET系列。5.一种包含如权利要求4所述的表达载体的工程菌，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿旭东，林芝，胡致伟，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：