玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，其cDNA核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；还公开了通过降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用和提高柚皮素含量的应用。实验证实，通过对ZmNOMT转基因过表达阳性株系的病原真菌接种鉴定，发现ZmNOMT过表达阳性株系对多种玉米病害表现出感病表型，证明了ZmNOMT是一个新的感病基因。进一步利用CRISPR/CAS9技术，针对ZmNOMT设计两个靶点，对ZmNOMT进行基因编辑，发现ZmNOMT编辑株系中柚皮素含量显著提高；对ZmNOMT编辑株系进行病原菌接种鉴定，发现ZmNOMT编辑株系表现出对多种玉米真菌病害产生广谱抗病性。本发明专利技术为玉米的抗病育种提供了新基因、新材料和新方法，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。

Maize naringin methyltransferase gene zmnomt and its application in broad-spectrum disease resistance of plants

【技术实现步骤摘要】
玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其通过降低ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用。

技术介绍

[0002]玉米(Zea mays L.)是我国第一大粮食作物，也是重要的饲料和工业原料，在国家粮食安全中占据重要地位。据预测，我国对玉米的需求会持续增加，年增长量将超过200万吨。受全球气候变化的影响，玉米病害日趋严重，给玉米的生产带来巨大损失。如黄淮海夏玉米区常年流行的茎腐病，1998年和2021年大流行的南方锈病，以及常年发生的穗腐病、大斑病和小斑病等。因而，培育优良玉米抗病新品种，对玉米的遗传改良和农业生产具有非常重要的意义。
[0003]除了抗病基因，植物中还存在很多感病基因。近年来，随着生物技术的发展，利用基因编辑技术对感病基因进行编辑改造，可以提高植物广谱抗病性。如大麦感病基因mlo隐性突变体对大麦白粉病表现出广谱、持久的防治作用，已经在欧洲大麦农业中有效使用了约40年。通过CRISPR/Cas9对六倍体小麦中的Tamlo三个同源基因进行编辑得到新的Tamlo突变体，使小麦表现出对白粉病的广谱抗性，并且该突变体的产量性状与野生型没有显著差别(LI S,LIN D,ZHANG Y,et al.Genome
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edited powdery mildew resistance in wheat without growth penalties[J].Nature,2022,602(7897):455
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460)。利用CRISPR/Cas9技术创制了易感基因Pi21和Bsr
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d1的功能缺失突变体，增加了对稻瘟病菌的广谱抗性；易感基因Xa5的敲除突变体增加了对水稻黄单胞菌引起的白叶枯病的抗性，并且这三个易感基因的三重突变体显著增强了对水稻稻瘟病菌和白叶枯病的抗性，与野生型植物相比，三重突变体在主要农艺性状上没有显著差异(TAO H,SHI X,HE F,et al.Engineering broad
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spectrum disease
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resistant rice by editing multiple susceptibility genes[J].Journal of Integrative Plant Biology,2021,63(9):1639
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1648)。因而，通过基因编辑改造感病基因，可以有效提高作物的广谱抗性，并且不影响作物的产量。但目前可供开发利用的候选基因较少，不能满足农业生产的需要，亟需挖掘新的感病基因作为基因编辑的靶点。
[0004]植物抗毒素是一类小分子次级代谢产物，在植物抗病中发挥重要功能，受病原菌侵染等生物胁迫和非生物胁迫诱导而大量积累。抗毒素可以通过抑制真菌菌丝生长而抑制病原菌的扩散，在水稻中已经分离出16种萜类抗毒素以及一个类黄酮抗毒素—樱花木素(sakuranetin)。樱花木素被认为是水稻中最重要的植物抗毒素之一，通常在未受胁迫的水稻叶片中很难检测到，但当受到生物或非生物胁迫(如水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻黄单胞菌、水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)、紫外线(UV)照射、氯化铜或茉莉酸(JA)处理等)后会迅速诱导樱花木素的生物合成。水稻中樱花木素是由另一种黄酮类物质柚皮素(naringenin)经甲基化合成。柚皮素是多种黄酮和类黄酮类化合物合成过程
中的关键中间体，在植物中将其作为一种防御化合物的研究并不多见。柚皮素对于一些细菌性病原菌具有较强的抗性，例如水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、水稻黄单胞菌、菊基腐病菌(Erwinia chrysanthemi)，此外也对部分真菌，如水稻稻瘟病菌、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)具有微弱抑制作用。基于其相对于樱花木素对水稻稻瘟病菌菌丝生长的微弱抑制作用，柚皮素被认为是水稻稻瘟病菌产生的一种对樱花木素具有解毒作用的物质。催化柚皮素产生樱花木素这一反应的酶被称为柚皮素甲基转移酶(NOMT，naringenin 7
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O
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methyltransferase),它是以S
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甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，在柚皮素第7位O原子上加上一个甲基而形成。目前对于NOMT的生物学功能研究较少，只在水稻中克隆到了OsNOMT并发现它能以柚皮素为底物催化生成樱花木素(SHIMIZU T,LIN F,HASEGAWA M,et al.Purification and identification of naringenin 7
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O
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Methyltransferase,a key enzyme in biosynthesis of flavonoid phytoalexin sakuranetin in rice.The Journal of Biological Chemistry,2012,287:19315
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19325)，而关于NOMT直接参与植物抗病的功能尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对目前技术的不足，本专利技术的目的是提供一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其通过降低ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用。
[0006]本专利技术所述的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，其特征在于：所述基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT编码的氨基酸序列，其特征在于：所述基因ZmNOMT编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术提供了一种含有上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为pCAMBIA3301::ZmNOMT。
[0009]本专利技术提供了一种通过降低上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用；其中，所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'
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、3'
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非翻译区的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达降低同样具有提高植物广谱抗病性的功能；所述降低基因ZmNOMT表达的方法中，除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、如EMS诱变的化学诱变或物理诱变等任何一种降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT表达的方法；所述方法得到的广谱抗病材料包括将表现出增加抗病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，其特征在于：所述基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT编码的氨基酸序列，其特征在于：所述基因ZmNOMT编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种含权利要求1所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为pCAMBIA3301::ZmNOMT。4.一种通过降低权利要求1所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用；其中，所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'
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、3'
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非翻译区的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达降低同样具有提高植物广谱抗病性的功能；所述降低基因ZmNOMT表达的方法中，除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、EMS诱变的化学诱变或物理诱变任何一种降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT表达的方法；所述方法得到的广谱抗病材料包括将表现出增加抗病性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加抗病性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述玉米柚皮素甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王官锋，李雅洁，刘孟洁，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：