罗汉果来源糖基转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了罗汉果来源糖基转移酶突变体，其氨基酸序列具有所述发生突变的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有糖基转移酶活性的功能性片段。可以有效催化黄酮类糖基化反应，相比于野生型糖基转移酶突变体酶具有较好的区域选择性。突变体酶具有较好的区域选择性。突变体酶具有较好的区域选择性。

【技术实现步骤摘要】
罗汉果来源糖基转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及具有不同区域选择性的罗汉果来源糖基转移酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]天然产物糖基化修饰是植物活性物质合成关键步骤。在天然产物糖基化过程中，由于糖基转移酶所能催化的潜在糖基化位点多样，导致多种糖基化产物的生成，降低了目标糖苷的转化率。利用蛋白质工程、定点突变的方法对糖基转移酶进行改造，得到具有良好的糖基化修饰功能、并能够用于合成目标产物的糖基转移酶突变体对于重要天然化合物的合成与应用具有重要的意义。
[0003]专利技术人从罗汉果中预测并实验验证了罗汉果来源的糖基转移酶UGT74AC2在黄酮类(水飞蓟宾、山奈酚、白杨素、橙皮素、黄豆苷元、毛蕊异黄酮、鹰嘴豆芽素等)以及含氮或含硫等化合物(4
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氨基二苯甲酮、3
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氨基二苯甲酮、3,4二氯苯胺、3,4二氯苯硫酚和2,6二氯苯硫酚)中的催化功能，但其专一性催化不理想。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供具有不同区域选择性的糖基转移酶突变体，可以有效催化黄酮类糖基化反应，相比于野生型糖基转移酶突变体酶具有较好的区域选择性。
[0005]本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。
[0007]其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中至少在G11、P12、F88、M119、Y145、T149、L200、V190和Y392位的氨基酸中的至少一个氨基酸残基发生突变。作为本专利技术的一个实施方式，突变是指序列中原氨基酸被1个或多个的其他氨基酸残基取代。
[0008]其他氨基酸残基为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中之一。
[0009]所述糖基转移酶突变体包括对应于SEQ ID NO:1，发生如下位点的取代：G11Y、Y145F、P12Y、P12G、F88S、M119L、M196L、M119W、L200W、L200F、L200Y、L200M、Y145W、Y392T、V190I、V190W中的任一种或二种以上的组合。优选组合突变包括：V190I/M119Q、V190I/L200M、V190I/Y392S、G11Y/Y145F、P12Y/L200W、Y392T/L43A、Y392T/F88M、Y392T/T149V、Y392T/M196N、Y392T/L200M、Y392T/K287Y。
[0010]在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体同时包括对应于SEQ ID NO:1的第11位甘氨酸和第145位酪氨酸的突变，例如位于第11位甘氨酸G突变为酪氨酸Y，同时第145位
酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，该突变体能够对水飞蓟宾的C3位羟基和C7位羟基同时进行糖基化修饰形成双糖基化产物，并且双糖基化产物的比例能够达到99％以上。
[0011]在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体至少包括对应于SEQ ID NO:1的第12位脯氨酸P突变为酪氨酸、第200位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F或色氨酸W或第145位酪氨酸Y突变为色氨酸W；优选，所述糖基转移酶突变体包括如下位点的突变：P12Y和L200W，该突变体能够对水飞蓟宾的C7位羟基进行选择性糖基化，且选择性能达到99％以上。
[0012]在一个实施方案中，所述糖基转移酶突变体同时包括对应于SEQ ID NO:1的第392位酪氨酸或第190位缬氨酸V的突变，例如位于第392位酪氨酸Y突变为苏氨酸T，或第190位缬氨酸V的突变异亮氨酸I。优选，所述糖基转移酶突变体包括如下位点的突变：Y392T和T149V，该突变体能够选择性糖基化水飞蓟宾C3羟基，且选择性能达到94％以上。
[0013]本专利技术还提供编码所述糖基转移酶突变体的核酸序列，所述核酸序列可以是根据所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列得到。
[0014]本专利技术还涉及包含所述核酸序列的表达盒、包含所述核酸或者表达盒的表达载体。进一步地，本专利技术还提供包含所述核酸序列、表达盒或者所述载体的宿主细胞，例如用所述核酸序列、表达盒或者载体转化或转染原始宿主细胞，形成转化体。本专利技术所述的表达盒，还可以任选地包括增强子或其他必须元件。
[0015]在一个具体实施方案中，所述表达盒包含表达所述变体的所有元件，包括在宿主细胞中转录和翻译过程中所必须的元件，例如，所述表达盒包括启动子和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现所述变体表达的启动子和终止子。
[0016]本专利技术还提供了所述糖基转移酶突变体的应用，所述突变体用于催化糖基受体，即用于催化来自糖基供体的糖基转移至糖基受体发生糖基化反应，例如黄酮类化合物的糖基化反应。优选，所述糖基受体包括黄酮类化合物、含氮或硫原子化合物。
[0017]所述糖基受体选自黄酮类化合物、含氮、硫原子的化合物；优选地，所述突变体催化如下任一种或多种糖基化反应：
[0018](1)专一性催化生成黄酮类化合物如水飞蓟宾的C3和C7位羟基糖基化反应；
[0019](2)专一性催化黄酮类化合物如水飞蓟宾的C3位羟基糖基化反应；
[0020](3)专一性催化黄酮类化合物如水飞蓟宾的C7位羟基糖基化反应；
[0021](4)催化含氮、硫原子化合物的糖基化反应。
[0022]所述糖基受体选自水飞蓟宾、山奈酚、白杨素、橙皮素、黄豆苷元、毛蕊异黄酮、鹰嘴豆芽素中的任一种；含氮、硫原子化合物如4
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氨基二苯甲酮、3
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氨基二苯甲酮、3,4二氯苯胺、3,4二氯苯硫酚和2,6二氯苯硫酚中的任一种；优选地，所述糖基供体选自UDP
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葡萄糖，ADP
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葡萄糖，TDP
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葡萄糖，CDP
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葡萄糖，GDP
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葡萄糖，UDP
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半乳糖醛酸，ADP
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半乳糖醛酸，TDP
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半乳糖醛酸，CDP
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半乳糖醛酸，GDP
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半乳糖醛酸，UDP
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半乳糖，ADP
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半乳糖，TDP
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半乳糖，CDP
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半乳糖，GDP
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半乳糖，UDP
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阿拉伯糖，ADP
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阿拉伯糖，TDP
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阿拉伯糖，CDP
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阿拉伯糖，GDP
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阿拉伯糖，UDP
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鼠李糖，ADP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.罗汉果来源糖基转移酶突变体，其特征是，氨基酸序列具有所述发生突变的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有糖基转移酶活性的功能性片段。2.根据权利要求1所述的罗汉果来源糖基转移酶突变体，其特征是，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中至少在G11、P12、F88、M119、Y145、T149、L200、V190和Y392位的氨基酸中的至少一个氨基酸残基发生突变。3.根据权利要求1所述的罗汉果来源糖基转移酶突变体，其特征是，对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，发生如下位点的取代为G11Y、Y145F、P12Y、P12G、F88S、M119L、M196L、M119W、L200W、L200F、L200Y、L200M、Y145W、Y392T、V190I和V190W中的任一种或二种以上的组合。4.根据权利要求1或2或3所述的罗汉果来源糖基转移酶突变体，其特征是，选自以下突变体的任意一种：所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，11位甘氨酸被取代为酪氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，145位酪氨酸被取代为苯丙氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，12位脯氨酸被取代为酪氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，12位脯氨酸被取代为甘氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，88位苯丙氨酸被取代为丝氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，119位甲硫氨酸被取代为亮氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，196位甲硫氨酸被取代为亮氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，119位甲硫氨酸被取代为色氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，200位亮氨酸被取代为色氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，200位亮氨酸被取代为苯丙氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，200位亮氨酸被取代为酪氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，200位亮氨酸被取代为甲硫氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，145位酪氨酸被取代为色氨酸的突变体；所述SEQ ID NO:1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娇，宋云飞，孙媛霞，李杰，张学礼，李元元，戴住波，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：